Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek
Summary
Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.
Abstract
The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.
Introduction
Duyusal çevresi ve alt colliculus arasında bilgi ehemmiyetli işlem olmasına rağmen, bu işitsel korteks ulaşmadan önce işitsel sistemde, önemli ölçüde ek bir işlem vardır. Biz işlem yapılması ve bu dönüşüm beyin gelen duyusal bilgileri yorumlamak için izin verir nasıl bu nedenle çok az nasıl hakkında çok az şey biliyoruz. Olfaction hariç, duyuların her biri başlangıçta sinyal korteks yükselir olarak düşmektedir yüksek sadakat ile yönlendirilen periferik sinyaller ile çok benzer bir organizasyona sahiptir. Korteks daha sonra gelen bilgiyi modüle alt yapılarına projeksiyonlar gönderir. Bu karmaşık sistem in vivo hem de in vitro olarak preparatlar bir dizi çeşitli yollarla çalışılmıştır. Eski, tüm bağlantıların duyusal girdileri kontrol ve ölçüm yaparken, bağlantıların herhangi bir set incelemek için araştırmacı sağlayan bozulmamışherhangi bir alanda çıktı. Bu yaklaşımla, yoğun karmaşık çıkış sebebiyet veren, diğer duyusal girdilerin, uyarılma ve dikkat gibi diğer girdilerin, çok çeşitli hiçbir kontrole çok az var. In vitro beyin dilimleri tek bir set ya yakalamak için kesilmiş Araştırmacılar uyarmak ve afferentler veya beyin bölgelerinin çeşitli değerlendirmek için izin projeksiyonlar, ya da iki bağlı beyin alanları,. Bunlar genellikle talamus giriş veya talamus ve korteks onun çıkış ya 2-5 korunur talamokortikal veya tectothalamic ya dilimleri vardır. Bu preparatlar, farmakolojik, elektrik ve Optogenetic manipülasyon geniş bir çeşitliliği için izin verir. Bununla birlikte, sadece iki beyin bölgeleri, esas olarak bilgi aktarımı değerlendirmek ve talamus geçerken bilgi dönüşümünü değerlendirmek için kabiliyetinden yoksundur. Ayrıca dikkat modülasyonunda rol oynayabilir retikülo-talamik projeksiyon, 6-9 prBu dilim ESENT. Burada nasıl talamus kapıları ve filtreler bilgi benzersiz bir perspektif vermek için talamus çeşitli girdilerin araştırmacı kontrolü sağlar önceki hazırlık 1, üzerine iyileştirmeler göstermektedir. Biz çift tek hücre düzeyinde çeşitli girdilerin etkisini ölçmek için dilim bağlantısı ve büyük ölçekli aktivasyon analizi, nöronal nüfus analizi için talamus kalsiyum görüntüleme ve tek bir hücre kayıt değerlendirmek için flavoprotein otofloresans görüntüleme ile bu yeni dilim hazırlanması.
Bu yaygın bağlantıları sürdürmek yardımcı olmak için biz de gelişmiş perfüzyon için dilim yükseltmek için yerinde beyin dilim ve bir köprü tutmak için, normal dilim çapa (aka "harp") olarak değişiklikler bir dizi geliştirdik. Arp dilim çevreleyen ve arp dizeleri için özelleştirilebilir bağlantı noktaları için izin vermek için modifiye edilmiş at nalı şeklinde dizayn edilmiştir. Üç dizeleriEkli i) bir ii) bir AC kaudal kenarına IC kaudal kenarından uzanır ve iii) bir bir alana dilimin iç kenarına gelen diyagonal bir biçimde uzanır, dilim medial kenarı boyunca yatay olarak yer alacağı şekilde AC rostralinde (Şekil 1A bakınız). Dizeleri dilim bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için dilim bir basınç azalması miktarı izin arp (siyanoakrilat yapıştırıcı) ile yapıştırma çerçevede Küçük çentikler (Şekil 1B bakınız). Üç boyutlu baskı kullanarak, dokusu üstünde ve altında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ideal akışı için izin benzersiz özellikler, yanı sıra köprülere özel tasarım arp edebiliyoruz. Bu aynı zamanda yama kelepçe elektrofizyoloji için doku nüfuz ışık geniş alanları korur.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.
Materials
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100x15mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35x10mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
Referências
- Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse. J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).
- Agmon, A., Connors, B. Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro. Neuro. 41, 365-379 (1991).
- Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro. J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).
- Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. PNAS. 107, 372-377 (2010).
- MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. A visual thalamocortical slice. Nat meth. 3, 129-134 (2006).
- Crabtree, J. W., Isaac, J. T. New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus. J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).
- McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons. J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).
- Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat. J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).
- Zikopoulos, B., Barbas, H. Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms. J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).
- Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal. Neuron. 38, 529-545 (2003).
- Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus. J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).
- Ehret, G. Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning. Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).
- Mikaelian, D., Ruben, R. Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy. Acta. 59, 451-461 (1965).
