Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging
Summary
L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.
Abstract
The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.
Introduction
Nel sistema uditivo, anche se vi è sostanziale elaborazione di informazioni tra la periferia sensoriale e collicolo inferiore, vi è una notevole ulteriore elaborazione prima che raggiunga la corteccia uditiva. Sappiamo molto poco su come che l'elaborazione è fatto e quindi poco su come queste trasformazioni permette al cervello di interpretare le informazioni sensoriali in entrata. Con l'eccezione dell'olfatto, ognuno dei sensi ha un'organizzazione molto simile con segnali periferici inizialmente inoltrato ad alta fedeltà che diminuisce all'aumentare del segnale di sale alla corteccia. La corteccia invia proiezioni alle strutture inferiori per modulare ulteriormente le informazioni in entrata. Questo complesso sistema è stato studiato in una varietà di modi in vivo così come in un certo numero di preparati in vitro. Nel primo caso, tutte le connessioni sono intatte, consentendo al ricercatore di sondare qualsiasi insieme di collegamenti, controllando l'input sensoriale e misurandouscita in una determinata area. Con questo approccio, non vi è poco o nessun controllo della grande varietà di altri fattori, inclusi altri input sensoriali, eccitazione, e attenzione, dando luogo ad una uscita intensamente complesso. In vitro, fettine cerebrali sono stati tagliati per catturare un singolo set di proiezioni, o due aree cerebrali connesse, che permettono ai ricercatori di stimolare e valutare afferenze o aree cerebrali diverse. Si tratta spesso di fette o talamocorticali o tectothalamic in cui o l'ingresso al talamo o il talamo e la sua uscita alla corteccia sono conservati 2-5. Queste preparazioni consentono un'ampia varietà di manipolazioni farmacologiche, elettrici, e optogenetic. Tuttavia con solo due regioni del cervello, essi sono principalmente valutano il trasferimento di informazioni e non hanno la capacità di valutare la trasformazione delle informazioni che passa attraverso il talamo. Anche la proiezione reticolo-talamo, che possono svolgere un ruolo nella modulazione attenzione 6-9 è prESENT in questa fetta. Qui mostriamo miglioramenti su nostra precedente preparazione 1, che permette il controllo investigatore di vari ingressi al talamo di dare una prospettiva unica di come le porte talamo e filtri informazioni. Abbiamo paio questo romanzo preparazione fetta con immagini flavoproteina autofluorescenza per valutare la connettività fetta e l'analisi di attivazione su larga scala, l'imaging calcio nel talamo per neuronale analisi di popolazione, e la registrazione singola cellula per misurare l'impatto dei vari ingressi su un livello di singola cellula.
Per aiutare a mantenere queste connessioni diffuse abbiamo anche sviluppato una serie di modifiche del normale ancoraggio fetta (alias "arpa") per la tenuta della fetta cervello in luogo e un ponte di elevare la fetta per una migliore perfusione. L'arpa è stato progettato in un ferro di cavallo modificata per circondare la fetta e consentire punti di fissaggio personalizzabili per le corde dell'arpa. Tre stringhe sonoallegata tale che i) uno si trova orizzontalmente lungo il bordo mediale della fetta, ii) uno estende dal bordo caudale del IC all'estremità caudale della CA e iii) uno estende diagonalmente dal bordo mediale della fetta un'area rostrale alla CA (vedere Figura 1A). Piccoli tacche del telaio per incollaggio (con colla cianoacrilato) dell'arpa stringhe permettono una ridotta quantità di pressione sulla fetta per aiutare a mantenere l'integrità fetta (vedere Figura 1B). Utilizzando stampa tridimensionale, possiamo arpe progettazione personalizzata alle nostre specifiche uniche, così come i ponti che consentono il flusso ideale di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sopra e sotto il tessuto. Questo mantiene anche ampie aree per la luce di penetrare il tessuto per la patch clamp elettrofisiologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.
Materials
| High sucrose cutting solution | in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Low calcium aCSF | in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| aCSF | in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4 | ||
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| DMSO | Life Technologies | D12345 | Lot: 1572C502 |
| Fura-2AM | Life Technologies | F1201 | Lot: 144912 |
| Pluronic F-127 | Life Technologies | P3000MP | Lot: 1499369 |
| Large culture dish | Fisherbrand | 08-757-13 | 100x15mm culture dish |
| Small culture dish | Falcon | 353001 | 35x10mm culture dish |
| Raised culture membrane | Millicell | PICMORG50 | Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice. |
| Flavoprotein imaging fluorescence cube | Olympus | UMNIB | 470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass. We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here. |
| Calcium imaging fluorescence cube | Omega Optical | BX-18 | XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission |
| Agar for blocking brain | 3% by weight in water | ||
| Viper si Stereo Lithography Apparatus | 3D Systems |
Referências
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