Modifisering av en Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Innlemming 3-D utskrift av Chamber Komponenter og Multi-skala Optical Imaging

Summary

Bruke flere vinkler for å kutte musen valpen hjernen, forbedrer vi på et tidligere beskrevet akutt hjerne skive som fanger sammenhengene mellom de fleste av de store auditive midthjernen og forhjernen strukturer.

Abstract

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice¹, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Introduction

I hørselssystemet, selv om det er betydelig bearbeiding av informasjon mellom sensorisk periferien og mindreverdig colliculus er det betydelig ytterligere behandling før det når auditiv cortex. Vi vet svært lite om hvordan det behandlingen er gjort, og derfor lite om hvordan det transformasjon tillater hjernen å tolke innkommende sensorisk informasjon. Med unntak av luktesans, har hver av sansene en svært lik organisasjon med perifere signaler først å bli videreformidlet med high fidelity som avtar som signalet stiger til hjernebarken. Cortex sender da fremført til de lavere strukturer for å ytterligere modulere innkommende informasjon. Dette komplekse systemet har blitt studert i en rekke måter in vivo så vel som i en rekke in vitro-preparater. I det tidligere, alle koblingene er intakte, slik forskeren å sondere noen sett med tilkoblinger, mens kontrollere sanseinntrykk og målingproduksjon i et gitt område. Med denne fremgangsmåten, er det liten eller ingen kontroll med stort utvalg av andre innganger, inkludert andre sanseinntrykk, opphisselse og oppmerksomhet, gir opphav til en intens komplekse utgang. In vitro, har hjerneskiver blitt kuttet for å fange enten et enkelt sett av projeksjoner, eller to tilkoblede hjerneområder, som tillater forskere å stimulere og evaluere ulike afferenter eller hjerneområder. Disse er ofte enten thalamocortical eller tectothalamic skiver der enten innspill til thalamus eller thalamus og dens utgang til hjernebarken er bevart ^2-5. Disse preparatene gir mulighet for et bredt spekter av farmakologiske, elektriske, og optogenetic manipulasjoner. Men med bare to hjerneregioner, er de først og fremst evaluere overføring av informasjon, og mangler evnen til å vurdere omdanning av informasjon som det passerer gjennom thalamus. Også reticulo-thalamiske projeksjon, som kan spille en rolle i oppmerksomhet modulasjon ^6-9 er prESENT i dette stykket. Her kan vi vise forbedringer ved vår tidligere ^fremstilling 1, som tillater søkeren kontroll av forskjellige inngangssignaler til thalamus for å gi et unikt perspektiv hvordan thalamus portene og filtre informasjon. Vi par denne romanen skive forberedelse med flavoprotein autofluorescence bildebehandling for å vurdere skive tilkobling og storskala aktiveringsanalyser, kalsium bildebehandling i thalamus for nevronale befolkningen analyse, og enkelt celle opptak for å måle effekten av de forskjellige inngangene på en enkelt celle nivå.

For å bidra til å opprettholde disse omfattende forbindelsene har vi også utviklet en rekke modifikasjoner av den normale skive ankeret (aka "harpe") for å holde hjernen skive på plass og en bro for å heve skive for bedre perfusjon. Harpen er designet i en modifisert hesteskoform til surround skive og gir mulighet for tilpassfestepunkter for harpe strengene. Tre strenger erfestet slik at i) en ligger horisontalt langs den mediale kant av stykket, ii) en strekker seg fra hale kanten av IC til kaudal kanten av AC og iii) en forløper diagonalt fra den mediale kant av skiven til et område rostralt til AC (se figur 1A). Små fordypninger i rammen for liming (med cyanoakrylatlim) av harpe strenger gi rom for en redusert mengde press på skive for å opprettholde skive integritet (se figur 1B). Ved å bruke tredimensjonal utskrift, er vi i stand til å spesialtilpasse harper til våre unike spesifikasjoner, samt broer som gir mulighet for ideelle flyt av kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) over og under vev. Dette opprettholder også store områder for lett å trenge inn i vev for patch clamp elektrofysiologi.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Illinois. Alle dyrene ble plassert i dyreinstitusjoner godkjent av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere antall dyr som brukes og for å redusere lidelse i alle faser av studien. 1. Forberedelse til og fjerning av Brain fra Mouse for å ha klippet Forbered perfusjon og skive inkubasjon. Omtrent 30 minutter f?…

Representative Results

Et eksempel på colliculo-thalamocortical musehjerne skive erholdt i P15 mus er vist i figur 2. Den ideelle skive vil inneholde de fire store midthjernen og forhjernen hørbar strukturer IC, MGB, TRN, og AC, som alle aktiveres når IC stimuleres (Figur 2A). Ved hjelp av Fourier-analyse, er det spektrale effekt målt ved elektrisk stimulering frekvens, med tilkoblede områder av hjernen som viser aktivitet som er periodisk og rives ved stimulering frekvens 10….

Discussion

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system¹. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to…

Materials

High sucrose cutting solution			in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Low calcium aCSF			in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
aCSF			in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A360
DMSO	Life Technologies	D12345	Lot: 1572C502
Fura-2AM	Life Technologies	F1201	Lot: 144912
Pluronic F-127	Life Technologies	P3000MP	Lot: 1499369
Large culture dish	Fisherbrand	08-757-13	100x15mm culture dish
Small culture dish	Falcon	353001	35x10mm culture dish
Raised culture membrane	Millicell	PICMORG50	Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.
Flavoprotein imaging fluorescence cube	Olympus	UMNIB	470–490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.  We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.
Calcium imaging fluorescence cube	Omega Optical	BX-18	XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission
Agar for blocking brain			3% by weight in water
Viper si Stereo Lithography Apparatus	3D Systems