차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템
Summary
We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.
Abstract
본 연구에서 우리는 환자 유래 다발성 골수종 (MM) 세포의 감수성 및 이질성을 추정 생체 약물 민감성 분석 및 디지털 이미지 분석을 결합한 새로운 접근법을 설명한다. 이 방법은 환자 – 갓 외 기질 (콜라겐 또는 기저막 매트릭스)과 간질 (각각 포함하는 골수 미세 환경의 재구성 구성된 멀티 웰 플레이트에서 구현 미세 유체 챔버 내로 골수 흡 인물에서 추출 일차 MM 세포를 시드로 이루어져 유래 중간 엽 줄기 세포) 또는 인간 유래 혈관 내피 세포 (HUVEC를). 챔버는 다른 에이전트 및 농도로 마취하고, 디지털 카메라가 장착 된 전동식 현미경, 명 시야 현미경을 통해 96 시간 동안 순차적으로 촬상된다. 디지털 영상 분석 소프트웨어가 존재 또는 멤브레인의 움직임의 유무를 라이브 및 사균을 검출하고, 함수 O로 생존의 변화 곡선을 생성F 약물 농도와 노출 시간. 우리가 각각의 약물에 대한 종양의 감수성 인구의 파라미터뿐만 아니라 종양 이종 척도로서 본 하위 집단의 수를 결정하는 연산 모델을 사용한다. 이러한 환자 맞춤형 모델은 치료법을 시뮬레이트 및 임상 응답을 추정하는데 사용될 수있다.
Introduction
이 방법의 목적은 이들 결과 chemoresistant 서브 식별 할 수있는 충분한 정밀도로, 생리 학적 조건에 가능한 한 가깝게, 생체 에이전트 패널 일차 전지를 다발성 골수종 (MM)의 약물 감수성을 특성화하는 것이다 종양 부담하고, 집단 내의 궁극적 임상 응답을 추정하기위한 계산 모델 파라미터 화.
전산 모델은 암 호스트 치료의 상호 작용과 같은 복잡한 시스템을 분석 할 수있는 강력한 도구입니다. 그러나 모델은 데이터를 매개 변수화하는 데 사용되는만큼 좋다. 불행하게도, 문헌에서 사용할 수있는 대부분의 데이터는 종종 상호 배타적 실험 조건에서 수득 된 바와 같은 모델을 파라미터 화하는 현재의 형태로 사용될 수 없다. 따라서, 새로운 실험은 종종 필요한 실험 파라미터 세트를 얻는 것을 목표로해야한다. 대부분의 생존 분석은, 그러나, 파괴적이고 일이다우리는 시간 지점 소수 종종 단지 하나에 제한. 이것은 크게 이러한 실험은 시스템의 시간적 동역학에 관한 정보를 제공하지 못한다 감수성 때문에 분석의 사용은, 계산 모델을 매개 변수화 장애. 이것은 종종 따라서 가능한 실험 조건의 수를 제한하는, 샘플 당 몇 백만에 한정 생검 후 짧은 수명을 갖는다 일차 암세포, 특히 사실이다. 또한 대부분의 생존력 분석법은 상기 세포를 교란하고 행할 수 실험의 수를 제한하는, 프로토콜의 추가 작업을 추가 정량의 시간에 비 – 암 (기질) 세포에서 암의 분리를 필요 .
전에 40 년, 연어와 공동 작업자 1은 종양 세포의 감수성의 평가에 대한 시험 관내 콜로니 형성 분석에서 그 유명을 제안했다. 불행하게도,이 분석은 여러 MYE 인해 소수로 혼합 성공을제어 조건에서 콜로니를 형성 할 수 있었다 로마 (MM) 환자 샘플 : 그것은, MM 세포의 0.1 %로 0.001 %의 작은 서브 그룹은 복제 할 수 있다고 추정은 다발성 골수종 줄기 세포를 2로 지칭된다. 이로 인해, 심지어 더 최근의 모델 3에서, 분석의 성공률과 동시에 시험 할 수있는 약물의 수를 제한. (표준 또는 실험) MM 에이전트 사 년 전보다 더 많은 경우이 문제가 훨씬 더 중요하다.
두 환자는 특정 약물에 대한 "민감한"또는 "내성"이다 : 이러한 초기 분석의 주요 한계는 이분법 출력된다. 어떤 정보는 종양 인구의 감도와 이질성의 정도에 대한 제공되지 않습니다. 따라서, 빠르게 성장하는 내성 세포의 작은 하위 집단 환자가 치료에 "민감한"로 분류 될 수 있지만, 곧 재발 것입니다, 따라서하지 벤치료의 혜택을 받고 있습니다. 암 환자의 생존율 4,5- (OS)에서의 응답 시간의 중요성을 감안할 때, 이러한 분석이 올바르게 일관 OS를 추정 할 수 없었다 얼마나 명확하다.
순서 이러한 한계를 회피하고, 약물의 패널 맞춤 임상 응답을 추정 할 환자 별 계산 모델을 생성 할 수 있도록, 우리는 다발성 골수종 (MM) 세포 라인의 비파괴 시험 약물 민감성 방법을 개발 및 세포 외 기질과 기질 6 포함한 골수 미세 환경의 생체 재건 일차 MM 세포. 이 분석은, 그러나, 그 크기 및 비용 장비의 특정 부분에서 한 번에 수행 될 수있는 실험이나 약물의 수를 제한 특히 상업용 마이크로 유체 슬라이드에 의존하는 한계가 있었다.
여기에 설명 된 시스템은 높은으로이 원래의 분석을 확장비파괴 세포 생존율을 정량화하는 디지털 이미지 분석 알고리즘에 기초하여 약물의 시험 관내 스크리닝의 Organotypic 용량 반응 플랫폼, -throughput. 도 384 또는 1536 웰 플레이트의 각 차 MM 세포 외 기질 및 간질 환자 유래 성장 인자를 포함하여 골수 미세 환경의 3D 재구성이다. 라이브 현미경과 디지털 영상 분석은 용량 – 반응 표면을 생성하는 데 사용되는 다른 약물 농도에서 세포 사멸 이벤트를 검출하기 위해 사용된다. 시험 관내 데이터로부터 수학적 모델은 환자의 종양 부담 내의 크기 및 하위 집단의 감수성을 식별하고, 종양 (임상 처방 6에서 생리 학적 조건에 약물 (들)에 반응하는 방법을 시뮬레이션하기 위해 사용될 수있다 그림 1).
이 플랫폼의 주요 혁신은 다음과 같습니다 약물 승낙 당 필요한 암 세포의 () 작은 수 (1,000 ~ 10,000배급); (b) 약물 효능의 생리적 조건 (세포 외 매트릭스, 간질 환자 유래 성장 인자)의 평가; (c) 만 명 시야 촬상 보낸 생존 마커 (7)로부터는 독성, 생물 발광 형광 8 또는 9 세포를 형질 감염시키는 것이 필요도 사용되지 않는다; (d)는 연속 화상 농도 및 노출 시간 (약물 동력학)의 함수로서 약물의 효과를 제공한다; 및 (e) 시험 관내 및 전산 진화 모델과의 통합, 임상 적 결과 (6) (실바 외., 준비)를 추정한다.
디지털 이미지 분석 알고리즘이 간질 세포에서 암을 분별할 수 있도록 핵심 요소 중 바닥에 서로 다른 친 화성이다 웰 : MM 세포 부착, 및 간질 세포의 바닥에 부착하면서, 매트릭스에 현탁 유지하지 잘하고 스트레칭.
이러한 분리는 MM 및 심지어 기질에도 발생동시에 접종 및 배양 O / N 프로세스 중에 발생 재. 플레이트의 원심 분리기에서 스핀 다운 시딩 다음은이 과정을 더욱 가속. 기질이 낮은 프로파일과 어두운 그늘 (그림 2)을 유지하면서 결과적으로, MM 세포는 어두운 링으로 둘러싸인 원형 밝은 디스크와 같은 이미지에 나타납니다. 알고리즘의 조정 등의 크기 및 형상과 같은 다른 형태 적 특징에 기초하여 별도의 암과 기질로 할 수 있지만 이와 같이, 현재의 형태에서의 분석은, 비 – 부착 암세포에 가장 적합하다. 이 프로토콜에서 우리는 (골수 유래 중간 엽 줄기 세포) BMSC와 HUVEC를, 골수 간질 및 혈관 주위의 틈새를 대표로, 세포 외 기질 (콜라겐 및 기저막 매트릭스)의 두 종류뿐만 아니라 공동 배양 두 가지 유형을 서술 각각.
384- 웰 플레이트를 사용하여 약물 농도 및 당 5 개의 복제, 우리는 TES 수 있었다단일 환자의 샘플 (31) 다른 약물에 T 최대. 기업도 1은 로봇을 이용한 피펫 최적 분포를 나타낸다 1536 웰 플레이트에서이 수는, 3은 수동 세포 시딩 사용되는 레이아웃 (127)을 도시도이다. 그림 3에서 디자인, 각 384 웰 플레이트 (21) 약물 테스트 (7) 다른 약물, 또는 한 환자 샘플 3 환자 샘플을 수행 할 수 있습니다. 각각의 약물 농도는 5로 표시되고, 각각의 상태는 중복 접종된다. 4 제어 우물은 (어떤 약물이 추가되지 않습니다) (7) 약물 (예, 우물 36-39, 126-129 및 200-203)의 각 세트에 대한 씨앗을 품고있다. 사용되는 약물의 효능을 확인하기 위해 인간 골수종 세포주 (예, H929 또는 MM1.S)도 시딩하고 (웰 76-89)를 사용 약제의 각각의 가장 높은 농도에서 중복 마취이다. 양 세포주 제어는 투여 량 반응 곡선을 비교 AC 때문에 사용 약물, 충분한 효능을 가질 수 있습니다로스 실험. 두 개의 웰 (75 웰, 90) 촬상시 벤치 탑 인큐베이터에서 발생할 수있는 문제를 검출하는, 즉, 환경 조건에 대한 제어와 같은 골수종 세포주로 접종된다. 웰 열거 획득 시간을 감소시키고, 장비의 마모를 감소 현미경 동력 스테이지에 의해 덮여 거리를 감소시키기 위하여 지그재그 패턴을 따른다.
Protocol
Representative Results
Discussion
요약하면, 이것은 골수 재건 차 MM 세포 및 약물의 생체 약력학의 감수성을 정량화하는 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 프로토콜 내에서 중요한 단계는 우물의 적절한 파종하고 적절한 (예상 결과에 대한 그림 2 참조) 초점 : MM과 기질 세포가 균일하게 분포되어 있는지 확인, 그 기질 세포는 우물의 바닥에 부착되어 MM 모든 세포는 MM 세포 어두운 링으로 둘러싸인 밝은 디스?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 플로리다의 BANKHEAD – 콜리 팀 과학 그랜트 (2BT03), 건강 / 국립 암 연구소 (1R21CA164322-01) 및 모 피트 암 센터의 팀 과학 부여의 국립 연구소의 국가가 투자되었다. 이 작품은 H. 리 모 피트 암 센터 연구원, NCI 지정 종합 암 센터 (P30-CA076292)에서 중개 연구 핵심 시설에 의해 부분적으로 지원하고있다. 일차 전지에 대한 액세스는 모 피트 암 센터에서 전체 암 관리 프로토콜을 통해 가능하게되었다.
Materials
| EVOS FL AUTO | AMG | AMAFD1000 + AMC1000 | Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator. |
| 384-well plate CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid |
| 1,536-well plate CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood. |
| CD138 magnetic beads | Miltenyi | 130-051-301 | Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells. |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | Column for separation of cells. |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | Magnet for separation column. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC ) |
| RPMI-1640 media | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red |
| FBS Heat inactivated | GIBCO | 10082-147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| 3.1mg/mL Bovine collagen type I | Advanced Biomatrix | 5005-B | Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 | Robotic pipettor system |
Referências
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
- Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
- Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
- Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
- Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
- Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
- McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
- Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
- Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236 (2012).
