Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

Summary

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Abstract

En este trabajo se describe un nuevo método que combina ensayos ex vivo de sensibilidad de drogas y análisis de imágenes digitales para estimar quimiosensibilidad y heterogeneidad de mieloma múltiple las células derivadas del paciente (MM). Este enfoque consiste en la siembra de células MM primarias recién extraídos de aspirados de médula ósea en las cámaras de microfluidos implementadas en placas de múltiples pocillos, cada uno compuesto de una reconstrucción del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular (colágeno de la membrana basal o matriz) y el estroma (el paciente células madre mesenquimales derivadas) o células endoteliales derivadas de seres humanos (HUVEC). Las cámaras están drogados con diferentes agentes y concentraciones, y se crean imágenes de forma secuencial durante 96 horas a través de la microscopía de campo claro, en un microscopio motorizado equipado con una cámara digital. Software de análisis de imagen digital detecta células vivas y muertas de la presencia o ausencia de movimiento de la membrana, y genera curvas de cambio en la viabilidad como una función of concentración del fármaco y el tiempo de exposición. Usamos un modelo computacional para determinar los parámetros de la quimiosensibilidad de la población tumor para cada fármaco, así como el número de sub-poblaciones presentes como una medida de la heterogeneidad tumoral. Estos modelos adaptados al paciente se pueden utilizar para simular los regímenes terapéuticos y estimar la respuesta clínica.

Introduction

El objetivo de este método es caracterizar la sensibilidad a los fármacos de mieloma múltiple (MM) células primarias a un panel de agentes ex vivo, lo más cerca posible a las condiciones fisiológicas, y con suficiente precisión que estos resultados se pueden utilizar para identificar quimiorresistente sub- poblaciones dentro de la carga tumoral y, en última instancia, para parametrizar modelos computacionales diseñados para estimar la respuesta clínica.

Los modelos computacionales son herramientas poderosas para analizar sistemas complejos, como las interacciones huésped-terapia del cáncer. Sin embargo, los modelos sólo son tan buenos como los datos utilizados para parametrizar ellos. Desafortunadamente, la mayoría de los datos disponibles en la literatura no se pueden utilizar en su forma actual para parametrizar tales modelos, ya que a menudo se obtienen en condiciones experimentales mutuamente excluyentes. De este modo, los nuevos experimentos se requieren a menudo con el objetivo de obtener el conjunto de parámetros experimentales necesarios. La mayoría de los ensayos de viabilidad, sin embargo, son destructivas y THnos limitamos a un pequeño número de puntos de tiempo, a menudo sólo uno. Esto perjudica en gran medida el uso de ensayos chemosensitivity parametrizar modelos computacionales, ya que tales experimentos no proporcionan información sobre la dinámica temporal del sistema. Esto es especialmente cierto con las células de cáncer primario, que a menudo se limitan a unos pocos millones por muestra, y tienen una vida útil corta después de la biopsia, lo que limita el número de condiciones experimentales disponibles. Además, la mayoría de los ensayos de viabilidad requieren la separación del cáncer de las células no cancerosas (estroma) en el momento de la cuantificación, lo que añade trabajo extra para el protocolo, perturba aún más las células, y limita el número de experimentos que puede realizarse .

Hace 40 años, salmón y colaboradores ¹ propusieron su famoso ensayo de formación de colonias in vitro para la evaluación de la quimiosensibilidad de las células tumorales. Desafortunadamente este ensayo encontró un éxito desigual debido al pequeño número de múltiples myeloma (MM) muestras de pacientes que eran capaces de formar colonias bajo condiciones de control: Se estima que sólo un pequeño subgrupo de 0,001% a 0,1% de las células MM eran capaces de replicación, se denominan como células madre de mieloma múltiple ^2. Esto limita significativamente la tasa de éxito del ensayo y el número de medicamentos que podrían ser probado en un tiempo, incluso en modelos más recientes ^3. Este problema es mucho más importante ahora, cuando agentes MM (estándar o experimentales) son más numerosos que hace cuatro décadas.

Una limitación importante de estos primeros ensayos es su producción dichotomized: ya sea un paciente es "sensible" o "resistente" a un medicamento en particular. No se proporciona información sobre el grado de sensibilidad y la heterogeneidad de la población tumor. Por lo tanto, los pacientes con pequeñas subpoblaciones de células de rápido crecimiento resistentes serían clasificados como "sensibles" a la terapia, sino que recaer en breve, por lo que no beneficio de tratamiento. Dada la importancia de la duración de la respuesta en la supervivencia global (OS) de pacientes con cáncer ^{de 4,5,} está claro cómo estos ensayos no fueron capaces de estimar correctamente OS consistentemente.

Con el fin de evitar estas limitaciones, y ser capaz de generar modelos computacionales específicos del paciente que estimar la respuesta clínica personalizado a un grupo de medicamentos, hemos desarrollado un método para la sensibilidad de drogas prueba no destructiva de mieloma múltiple (MM) líneas celulares y las células MM primarias en una reconstrucción ex vivo del microambiente de la médula ósea, incluyendo la matriz extracelular y el estroma ^6. Este ensayo, sin embargo, tenía la limitación de depender de una diapositiva de microfluidos comercial en particular, cuyas dimensiones y el coste restringido el número de experimentos o medicamentos que podrían llevarse a cabo a la vez en un equipo determinado.

El sistema aquí descrito se extiende este ensayo original en un alto-throughput organotípicos plataforma de dosis-respuesta, para el cribado in vitro de fármacos, basado en un algoritmo de análisis de imagen digital para no destructiva cuantificar la viabilidad celular. Cada pocillo en 384 o 1536 pocillos placas es una reconstrucción 3D del microambiente de la médula ósea, incluyendo células primarias mm, matriz extracelular, y el estroma y factores de crecimiento derivados del paciente. Microscopía vivo y análisis digital de imágenes se utilizan para detectar eventos de muerte celular en diferentes concentraciones de fármaco, que se utilizan para generar superficies de dosis-respuesta. De los datos in vitro, un modelo matemático identifica el tamaño y la quimiosensibilidad de sub-poblaciones dentro de la carga tumoral del paciente, y se puede utilizar para simular cómo respondería el tumor al fármaco (s) en condiciones fisiológicas en un régimen de clínica ⁶ ( Figura 1).

Las principales novedades de esta plataforma son: (a) pequeño número de células cancerosas requeridos (1.000-10.000 por concent drogasración); (B) la evaluación de la eficacia del fármaco en condiciones fisiológicas (matriz extracelular, estroma, factores de crecimiento derivados del paciente); (C) Ninguna toxicidad de los marcadores de viabilidad ⁷ ya que sólo de imágenes de campo claro se utiliza, por lo tanto no hay necesidad de transfectar células con fluorescencia o bioluminiscencia ^{8 9;} (D) de formación de imágenes continua proporciona efecto de la droga como una función de la concentración y tiempo de exposición (farmacodinámica); y (e) la integración entre in vitro y modelos computacionales evolutivas, para estimar el resultado clínico ⁶ (Silva et al., en preparación).

El factor clave que permite que el algoritmo de análisis de imagen digital para discernir el cáncer de células del estroma es su diferente afinidad a la parte inferior del pozo: células MM no se adhieren, y permanecen en suspensión en la matriz, mientras que las células estromales se adhieren a la parte inferior de la bien y luego estirar.

Esta separación se produce a pesar de que MM y un estromare sembrado al mismo tiempo, y se produce durante el proceso de O / N de la incubación. El desacelerándose en la centrífuga después de la siembra de la placa se acelera aún más este proceso. Como consecuencia, las células MM aparecen en la imagen como discos redondos brillantes rodeadas por un anillo oscuro, mientras que el estroma mantiene un perfil bajo y un tono más oscuro (Figura 2). Por lo tanto, el ensayo en su forma actual es el más adecuado para las células cancerosas no adherentes, aunque los ajustes en el algoritmo se podría hacer con el cáncer independiente y estroma en base a otras características morfológicas, como el tamaño y forma. En este protocolo se describen dos tipos de matriz extracelular (colágeno y matriz de membrana basal), así como dos tipos de co-cultivos, con (células madre mesenquimales derivadas de médula ósea) BMSC y HUVECS, en representación de los nichos intersticiales y perivasculares de la médula ósea , respectivamente.

El uso de una placa de 384 pocillos, 5 concentraciones por drogas y dos repeticiones, que fueron capaces de test hasta 31 fármacos diferentes con la muestra de un solo paciente. En placas de 1536 pocillos este número es 127. La Figura 3 representa la disposición utilizada actualmente para la siembra de células manual, mientras que la Figura Suplementaria 1 representa la distribución óptima usando una pipeta robótica. En el diseño de la figura 3, cada placa de 384 pocillos puede llevar a 3 muestras de pacientes con 7 fármacos diferentes, o una muestra de pacientes evaluados con 21 drogas. Cada fármaco se representa por 5 concentraciones, y cada condición se siembra en los duplicados. 4 pozos de control (ningún fármaco añadido) se siembran para cada conjunto de 7 medicamentos (por ejemplo, pozos 36-39, 126-129 y 200-203). Para garantizar la potencia de los medicamentos que se utilizan, una línea celular de mieloma humano (por ejemplo, H929 o MM1.S) también es cabeza de serie, y drogada por duplicado a la mayor concentración de cada uno de los fármacos utilizados (pozos 76-89). El control de la línea de células positivas se asegura de que los medicamentos que se utilizan tienen una potencia adecuada, ya que sus curvas de respuesta de dosis son comparables acexperimentos Ross. Dos pocillos se sembraron con una línea celular de mieloma como control para las condiciones ambientales, en otras palabras, para detectar posibles problemas en la incubadora de banco durante la exploración (pozos 75 y 90). La enumeración de los pozos sigue un patrón en zigzag con el fin de reducir la distancia recorrida por la etapa motorizada del microscopio, lo que reduce el tiempo de adquisición y reduce el desgaste del equipo.

Protocol

El uso de células humanas derivadas de biopsias que se describen a continuación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Moffitt y llevó a cabo en el marco del ensayo clínico MCC # 14745 realizado en el Centro de Cáncer H. Lee Moffitt y el Instituto de Investigación. 1. Clasificación de las células MM de Médula Ósea aspirados Recoger aspirados de médula ósea (20 ml) de pacientes en la jeringa de heparina de sodio. Aislar las células mononuclea…

Representative Results

El flujo del experimento se describe brevemente en la Figura 1 Si todos los pasos se han completado con éxito, las imágenes obtenidas por el microscopio debe ser equivalente a la Figura 2:. Viven células MM deben verse claramente discos tan brillantes y BMSCs o HUVECs deben ser apenas visible y bien distribuida en el fondo. Como se ve en la Figura 2A, las células MM varían en tamaño de un paciente a otro, pero en general son más pequeños que las líneas celulare…

Discussion

En resumen, este es un método potente rendimiento y alta para cuantificar la quimiosensibilidad de las células MM primarias y farmacodinámica ex vivo de fármacos en una reconstrucción de la médula ósea. Los pasos críticos dentro de este protocolo son la siembra adecuada de los pozos y centrándose adecuada (véase la Figura 2 para los resultados esperados): asegurar que las células estromales MM y se distribuyen de manera uniforme, que las células estromales son adherentes a la parte …

Materials

EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1mg/mL Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system