Elektrofysiologi på Isolerte hjernestammen-ryggmarg Forberedelser fra nyfødt Gnagere Lar Neural Respiratory Network Utgang Recording

Summary

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Abstract

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Introduction

Breathing er en kompleks og viktig aktivitet styres av hjernen, slik at dioksygen (O ₂₎ opptak og karbondioksid (CO ₂₎ eliminering. Den sentrale respirasjonen er generert av et komplekst nettverk som ligger i hjernestammen i begge pattedyr ^1, amfibier ^2, reptiler ^3, fugler ^{4 og} fisker ^5. Selv om undersøkelse av puste kan behandles in vivo, nøyaktige mekanistiske undersøkelser krever direkte adgang for luftkontrollnettverk. For å oppnå dette, Adrian og Buytendijk utviklet en redusert gullfisk forberedelse, der elektroder plassert på hjernestammen overflaten posten den genererte rytme forbundet med gjelle ventilasjon ^5. Denne tilnærmingen ble deretter tilpasset ved Suzue i 1984 ^{6 for} bruk i nyfødte rotter. Ankomsten av dette preparatet har ført til betydelige fremskritt innen luftnevrobiologi. Siden det er relativt enkelt, den teknikk som presenteres here er mottagelig for et bredt spekter av grunnleggende undersøkelser av rytmiske motoriske atferd og deres opprinnelse i nyfødte gnagere.

Det overordnede målet med denne metoden er å spille inn den nevrale korrelerer av inspirasjons aktivitet, kalt en luftveislignende rytme fiktiv puste, produsert av luftnettet. Denne metoden kan brukes i et bredt spekter av forskningsmålene, målretting inspiratoriske svar på respiratoriske variasjoner eller farmakologi både villtype ⁷ og transgen ^{8 dyr.} Gitt at forsøk utføres ved en lav temperatur, uten sensoriske afferenter, og under betingelser hvor konsentrasjonen av glukose og O ₂ innenfor aCSF er høy, blitt reist spørsmål angående den fysiologiske betydningen av den innspilte signal. Mens det er klare forskjeller mellom in vivo og in vitro forhold (f.eks., Hyppigheten av inspiratoriske bursts) gjenstår det faktum at tilstedeværelsen avkjerneelementene i ^luftnettet 6 gjør det mulig å studere en robust rytme knyttet til en vital homeostatic funksjon ^9,10.

Begrunnelsen for utviklingen og bruken av denne teknikk er å legge til rette for direkte tilgang til hjernestammen elementer i luftnettet, som er neppe tilgjengelig in vivo, spesielt hos nyfødte. Hjernestammen er plassert under strengt kontrollerte forhold: den innspilte rytme er ikke modulert av perifere afferente innspill fra lungene eller carotis organer, slik at studien til å fokusere på den sentrale luft stasjonen selv ^11. Dermed er denne tilgangen utnyttes til å anvende stimuli og registrere utgangssignalet. I motsetning til pletysmografi opptak, er det respiratoriske rytme modulert av alle komponentene i hele kroppen (f.eks., Lunge distensjon, perifere chemosensors), noe som gjør det vanskelig å anvende nøyaktige stimuli.

I enewborn rotte, består protokollen for opptak av den fjerde ventrale roten signal på en isolert hjernestammen og en avkortet ryggmarg, opprettholdt i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF). Rytmen generert av hjernestammen-ryggmargs preparater er sammensatt av enkelt langsomme bursts som er knyttet til inspirasjons signal ^9. Isolerte hjernestammen-ryggmargs preparater er lett skrivbar hos rotter fra post-natal dag 0 til 4 (P0 – P4) ^7. Denne fremgangsmåten er ofte brukt til å evaluere hypoksisk respons i luftnettet, og også reaksjonen på hyperkapni, acidose eller narkotika. En akutt hypoksi protokollen er presentert her. Denne stimulering oppnås ved tilbaketrekking av O ₂ i aCSF; denne tilnærmingen er ofte brukt for å vurdere toleranse og respons til hypoksiske fornærmelser. Protokollen induserer en rytme depresjon fra det første minutt inntil slutten av hypoksi eksponering (figur 1) ^12. Dette depresjon reverseresunder post-hypoksisk utvinning ^12. Når det gjelder eksperimentell design, er det viktig å legge merke til at pons, som ligger ved rostralt del av hjernestammen, har en hemmende virkning på rytme generator ^8. Dermed preparater av komplett hjernestammen og rostralt ryggmarg vise en lavere rytme. Inkludering av pons i den isolerte utvalget for opptaket fastsettes i henhold til målet med eksperimentet ^13; studiet av pontin innflytelse på forlengede marg nettverket vil kreve opptak med og uten pons å sammenligne resultatene ^14. Videre er en av fordelene med denne teknikk er muligheten for å utvide den rostrale del av blandingen for å inkludere mesencefalisk og / eller diencephalic regioner ^15,16, noe som gjør det mulig å vurdere effekten av disse regionene på ponto-medullær luftnett.

Protocol

Denne metoden kreves bruk av forsøksdyr, tillates av Laval-universitetet Animal etiske komité (protokoll # 2012-170). 1. Oppsett og klargjøring Løsninger Forbered aCSF lagerløsninger i henhold til følgende oppskrifter 7,17. Andre oppskrifter med konsentrasjonsvariasjoner er tilgjengelige i litteraturen. Oppbevares stamløsninger ved 4 ° C i opptil en måned. Salt løsning: legg 75,39 g NaCl (129 mM endelig); 2,5 g KCl (3,35 mM endelig); 0…

Representative Results

Som nevnt i innledningen, er en av de viktigste fordelene med denne teknikken den direkte adgang til hjernestammen å anvende ulike stimuli. Som et eksempel, ble hypoksi anvendt her. Figur 1. AB viser en fullstendig protokoll opptak, med både normoksisk og hypoksiske betingelser. Figur 1.CE viser rytmen registreres i normoksisk forhold (dvs., gjennomboblet med 95% O2 og 5% aCSF CO 2 ved 26 ° C). Som tidligere vist i denne eksakte preparatet 11,</sup…

Discussion

Nøyaktig kvantifisering av respiratorisk aktivitet kan være utfordrende. Faktisk pust er en funksjon som kan være både automatisk og frivillig, og som moduleres i henhold til miljøet, kroppens behov, emosjonell tilstand og atferd. Fordelen med denne teknikken er isolering av nerveelementene som er ansvarlige for produksjonen av respiratoriske kommandoen. Dermed elektrofysiologiske opptak av hjernestammen-ryggmargs forberedelser og plethysmography er komplementære teknikker for å studere hele nevronale luftnett <e…

Materials

Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Use under hood
NaCl	Bioshop	SOD002
KCl	Bioshop	POC888
CaCl2	Bioshop	CCL444
MgCl2	Bioshop	MAG510
NaHCO3	Bioshop	SOB999
NaH2PO4	Bioshop	SPM306
D-glucose	Bioshop	GLU501
Carbogen	Linde	343-02-0006
Temperature Controller	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Suction electrode	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 573000
Differential AC amplifier	A-M Systems, Everett, WA, USA	model 1700
Moving averager	CWE, Ardmore, PA, USA	model MA-821
Data acquisition system	Dataq Instruments, Akron, OH, USA	model DI-720
LabChart software	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA
Prism sofware	Graphpad, La Jolla, CA, USA
Dissection chamber	Plastic box (e.g. petri box) will do
Recording chamber	Home made
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Micromanipulator	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA	KITE-R
Base	Kanetec, Bensenville, IL, USA	MB
Peristaltic pump	Gilson, Middleton, WI, USA	MINIPULS 3
Faraday Cage	Home made
Computer