Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Nylig isolerte tumor-spesifikke endotelceller (TEC) kan brukes til å utforske molekylære mekanismer av tumor angiogenese, og tjener som pt de vitro modell for å utvikle nye angiogeneseinhibitorer for kreft. Imidlertid er langvarig in vitro ekspansjon av murine endotelceller (EC) utfordrende på grunn av fenotypisk drift i kultur (endotelial-til-mesenchymale overgang) og forurensning med ikke-EC. Dette gjelder spesielt for TEC som lett utkonkurrert av ko-renset fibroblaster eller tumorceller i kultur. Her er en high fidelity isolasjon metode som utnytter immunomagnetisk berikelse kombinert med kolonien utvalg og in vitro ekspansjon beskrevet. Denne fremgangsmåten genererer rene EC fraksjoner som er helt fri for kontaminerende stromale eller tumorceller. Det er også vist at avstamning-spores Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus, brukt med protokollen beskrevet her, er et verdifullt verktøy for å verifisere mobilrenhet som de isolerte EC kolonier fra disse musene viser holdbar og strålende ZsGreen fluorescens i kultur.
Introduction
Endotelceller (EC) er viktig i utviklingen av faste tumorer. Fra initiering av den angiogene bryter i sovende tumor til formidling og såing av metastaser i fjerne områder, EC danne ledningene som gir blod, oksygen og næringsstoffer for å opprettholde pt tumorvekst. Som nylig foreslått, EC har også perfusjon-uavhengige funksjoner, og danner en nisje som støtter veksten av kreft stamceller og andre tumor stromale celler 2-5. Dermed høyt renset tumor-spesifikke EC (TEC) for in vitro kultur åpner for rutine funksjonelle studier som vil kaste lys over nye molekylære mekanismer som medierer tumorangiogenese og krysstale med tumorceller.
EC er svært spesialiserte avhengig av vevet opprinnelses 6. På grunn av den heterogene karakter av forskjellige tumortyper og svulsten mikromiljøet, kan også vise TEC unike egenskaper som gjenspeiler en tumorspesifikke fordypninger of blodkar. For eksempel er det påfallende variasjon i genekspresjonssignaturer i TEC isolert fra ulike typer eller grader av svulster 7,8. Imidlertid kan hyppig co-rensning av ikke-EC, spesielt tumorassosierte fibroblaster og tumorceller, med TEC forvirre genom-wide ekspresjon analyser. Disse uønskede celletyper er spesielt problematisk i studier som er avhengige av langsiktige in vitro utvidelse av TEC kulturer.
Beskrevet her er en high-fidelity metode som konsekvent produserer rene EF kulturer fra svulster og andre vev. Etter immunomagnetisk kolonne berikelse av EF-fraksjoner og fjerning av co-renset non-EC, til en ekstra kloning-ring trinn fange rene EF kolonier brukes 9. Hver koloni kan ekspanderes i kultur for flere passasjer uten at det oppstår forurensende ikke-EC. Denne metode gir også flere EC kloner fra en enkelt isoleringsprosedyren, som er ideelt for studiet av endothelial heterogenitet. I tillegg er det vist at Cdh5 cre: ZsGreen l / s / l reporter mus er et verdifullt verktøy for å generere "skjebne-kartlagt" og uutslettelig merket EC som opprettholder ZsGreen fluorescens i kultur 10. Med mindre justeringer i protokollen, skal denne metoden kunne tilpasses forskjellige typer svulst eller normalt vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av vanskelighetene med å oppnå rene primære TEC kulturer, mange in vitro-studier erstatning TEC med kommersielt tilgjengelige EC linjer eller primære EC så som humant navlevene EC (HUVEC) 13. Men disse EC populasjoner fra normalt vev bare tjene som en proxy for TEC som skiller seg markant fra sine vanlige kolleger. For eksempel, TEC er fenotypisk og funksjonelt unormal in vivo, og noen av disse avvikene kan være overførbare in vitro 14-18. TEC har avviken…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
Referências
- Folkman, J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors. Ann. Surg. 175 (3), 409-416 (1972).
- Butler, J. M., Kobayashi, H., Rafii, S. Instructive role of the vascular niche in promoting tumour growth and tissue repair by angiocrine factors. Nat. Rev. Cancer. 10 (2), 138-146 (2010).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Sci. Transl. Med. 3 (66), 66ra5 (2011).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11 (1), 69-82 (2007).
- Beck, B., et al. A vascular niche and a VEGF-Nrp1 loop regulate the initiation and stemness of skin tumours. Nature. 478 (7369), 399-403 (2011).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (1), a006429 (2012).
- Dudley, A. C. Tumor endothelial cells. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (3), a006536-a006536 (2012).
- Aird, W. C. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 271-281 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J. Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Xiao, L., Harrell, J. C., Perou, C. M., Dudley, A. C. Identification of a stable molecular signature in mammary tumor endothelial cells that persists in vitro. Angiogenesis. 17 (3), 511-518 (2014).
- Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9 (6), 713-725 (2003).
- Baluk, P., Hashizume, H., McDonald, D. M. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer. Curr. Opin. Genetics Dev. 15 (1), 102-111 (2005).
- Ghosh, K., et al. Tumor-derived endothelial cells exhibit aberrant Rho-mediated mechanosensing and abnormal angiogenesis in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (32), 11305-11310 (2008).
- Amin, D. N., Hida, K., Bielenberg, D. R., Klagsbrun, M. Tumor endothelial cells express epidermal growth factor receptor (EGFR) but not ErbB3 and are responsive to EGF and to EGFR kinase inhibitors. Cancer Res. 66 (4), 2173-2180 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Dudley, A. C., et al. Calcification of multipotent prostate tumor endothelium. Cancer Cell. 14 (3), 201-211 (2008).
- Dunleavey, J. M., et al. Vascular channels formed by subpopulations of PECAM1(+) melanoma cells. Nat. Comm. 5, 5200 (2014).
- St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
- Bhati, R., et al. Molecular characterization of human breast tumor vascular cells. Am. J. Pathol. 172 (5), 1381-1390 (2008).
- Johnson, C. S., Chung, I., Trump, D. L. Epigenetic silencing of CYP24 in the tumor microenvironment. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (1-2), 338-342 (2010).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. J. Cell Biol. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Zhang, J., Burridge, K. A., Friedman, M. H. In vivo differences between endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries revealed by microarray analysis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295 (4), H1556-H1561 (2008).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circ. Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. -. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31 (3), 598-607 (2011).
- Ginsberg, M., et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFβ suppression. Cell. 151 (3), 559-575 (2012).
- Sapino, A., et al. Expression of CD31 by cells of extensive ductal in situ and invasive carcinomas of the breast. J. Path. 194 (2), 254-261 (2001).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Cooley, B. C., et al. TGF-β signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Sci. Transl. Med. 6 (227), 227ra34-227ra34 (2014).
- Garcia, J., et al. Tie1 deficiency induces endothelial-mesenchymal transition. EMBO Rep. 13 (5), 431-439 (2012).
- Xiao, L., et al. Tumor endothelial cells with distinct patterns of TGFβ-driven endothelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 75 (7), 1244-1254 (2015).
- Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
- Wang, L., et al. Identification of a clonally expanding haematopoietic compartment in bone marrow. EMBO J. 32 (2), 219-230 (2012).
- Sawamiphak, S., et al. Ephrin-B2 regulates VEGFR2 function in developmental and tumour angiogenesis. Nature. 465 (7297), 487-491 (2010).
- Chi, J. -. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (19), 10623-10628 (2003).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev. Cell. 26 (2), 204-219 (2013).
- Ingram, D. A., et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105 (7), 2783-2786 (2005).
