We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Свежевыделенные опухолевые специфические эндотелиальные клетки (TEC) может быть использован для изучения молекулярных механизмов ангиогенеза опухоли и служат модели в пробирке для разработки новых ингибиторов ангиогенеза рака. Тем не менее, долгосрочные в пробирке расширения мышиных эндотелиальных клеток (ЭК) является сложной задачей из-за дрейфа в фенотипической культуры (переход эндотелия к мезенхимальных) и загрязнения с не-ЕС. Это особенно верно для TEC, которые легко outcompeted посредством взаимодействующих очищают фибробластов или опухолевых клеток в культуре. Здесь метод изоляции с высокой точностью, что использует иммуномагнитной обогащения в сочетании с выбором колонии и в расширении пробирке описано. Этот подход порождает чистые фракции ЕС, которые полностью свободны от загрязнения стромальных клеток или опухолевых. Он также показал, что клонов-прослеживается Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с, используемые при работе с протоколом, описанным в данном документе, являются ценным инструментом, чтобы проверить ячейкучистота, как изолированных колоний ЕС из этих мышах показывают прочный и блестящий ZsGreen флуоресценции в культуре.
Эндотелиальные клетки (ЭК) имеют важное значение при разработке твердых опухолей. Из инициации ангиогенного переключателя в неактивных опухолей к распространению и посева метастазов в отдаленных местах, ЕС образуют трубопроводы, которые обеспечивают крови, кислорода и питательных веществ для поддержания роста опухоли 1. Как недавно предложил, ЕС также перфузии-независимых функций и образуют нишу, которая поддерживает рост раковых стволовых клеток и других опухолевых клеток стромы 2-5. Таким образом, высокой степени очистки опухоли конкретных EC (TEC) для культуры в пробирке позволяет рутинных функциональных исследований, которые проливают свет на новые молекулярные механизмы посредников опухолевый ангиогенез и перекрестные помехи с опухолевыми клетками.
ЕС являются узкоспециализированными в зависимости от ткани происхождения 6. В связи с гетерогенной природы различных типов опухолей и микросреды опухоли, ТЭЦ может также отображать уникальные особенности, которые отражают опухоли конкретных специализации Oе сосудистой. Например, поражает изменчивость сигнатур экспрессии генов в TEC, выделенных из различных типов или классов опухолей 7,8. Тем не менее, часто совместно очистка не-ЕС, особенно опухолеассоциированных фибробластов и опухолевых клеток, с TEC может посрамить выражение генома анализов. Эти нежелательные типы клеток особенно проблематичным в исследованиях, которые полагаются на долгосрочной перспективе в пробирке расширения ТИК культур.
Описанный здесь метод высококачественный, которые последовательно производит чистые культуры ЕС от опухолей и других тканей. После обогащения иммуномагнитный столбца фракций ЕС и удаления совместно очищают не-ЕС, дополнительный шаг клонирования кольцо для захвата чистых колоний ЕС используется 9. Каждая колония может быть расширена в культуре для многих пассажей без возникновения загрязнения не входящих в ЕС. Этот метод также дает несколько клонов ЕС от одной процедуры изоляции, которая идеально подходит для изучения эндоthelial неоднородность. Кроме того, показано, что Cdh5 CRE: / л репортер мышей ZsGreen л / с ценным инструментом для создания "судьба-карту" и неизгладимо-маркировку СЕ которые поддерживают ZsGreen флуоресценции в культуре 10. С незначительными изменениями к протоколу, этот метод должен быть адаптированы к различным типам опухолевых или нормальных тканей.
Из-за трудностей в получении чистых первичных TEC культур, многие в пробирке исследования заменитель TEC с коммерчески доступных линий ЕС или первичной ЕС, таких как пупочной вены человека (HUVEC ЕС) 13. Тем не менее, эти группы населения ЕС от нормальных тканей может служить то…
The authors have nothing to disclose.
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
Sterile water | – | – | |
Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
6-well tissue culture plates | Corning | – | |
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
Fine-tip marker | – | – | |
Hemocytometer | – | – | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
Tissue culture hood | – | – | |
Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
Liquid nitrogen freezer | – | – | |
Microplate or rotary shaker | – | – | |
Phase contrast light microscope | – | – |