Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
Recién aisladas células endoteliales específicos de tumores (TEC) se pueden usar para explorar los mecanismos moleculares de la angiogénesis tumoral y servir como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos inhibidores de la angiogénesis para el cáncer. Sin embargo, a largo plazo en la expansión in vitro de células endoteliales murinas (CE) es un reto debido a la deriva fenotípica en la cultura (transición-endotelial-mesenquimal) y la contaminación con no comunitario. Esto es especialmente cierto para TEC que se outcompeted fácilmente por co-purificado fibroblastos o células tumorales en cultivo. Aquí, un método de aislamiento de alta fidelidad que se aprovecha de enriquecimiento inmunomagnética junto con la selección de la colonia y la expansión in vitro se describe. Este enfoque genera fracciones CE puros que son totalmente libre de contaminación de las células del estroma o tumorales. También se muestra que el linaje de trazado de Cdh5 cre: / l reportero ratones ZsGreen l / s, que se utiliza con el protocolo descrito en este documento, son una valiosa herramienta para verificar celularpureza como las colonias de la CE aislados de estos ratones muestran fluorescencia ZsGreen duradero y brillante en la cultura.
Introduction
Las células endoteliales (CE) son esenciales durante el desarrollo de tumores sólidos. A partir de la iniciación del cambio angiogénico en los tumores latentes a la difusión y la siembra de metástasis en sitios distantes, EC formar los conductos que suministran sangre, oxígeno y nutrientes para sostener el crecimiento del tumor 1. Como se ha sugerido recientemente, EC también tiene funciones de perfusión independiente y formar un nicho que soporta el crecimiento de células madre de cáncer y otras células del estroma tumoral 2-5. Por lo tanto, altamente purificado específico de tumor CE (TCE) para el cultivo in vitro permite estudios funcionales de rutina que arrojará luz sobre nuevos mecanismos moleculares que median la angiogénesis tumoral y la diafonía con células tumorales.
CE son altamente especializados dependiendo del tejido de origen 6. Debido a la naturaleza heterogénea de diferentes tipos de tumores y el microambiente tumoral, TEC también puede mostrar características únicas que reflejan una especialización o específico de tumorf la vasculatura. Por ejemplo, no es sorprendente variabilidad en las firmas de expresión génica en TEC aisladas a partir de diferentes tipos o grados de tumores 7,8. Sin embargo, la co-purificación frecuente de no comunitario, especialmente los fibroblastos asociados al tumor y las células tumorales, con TEC puede confundir a los análisis de la expresión de todo el genoma. Estos tipos de células no deseadas son especialmente problemáticas en los estudios que se basan en a largo plazo en la expansión in vitro de cultivos de TEC.
Aquí descrito es un método de alta fidelidad que produce consistentemente culturas CE puros de tumores y otros tejidos. Tras enriquecimiento columna inmunomagnética de las fracciones de la CE y la eliminación de co-purificado no comunitario, un paso anillo clonación adicional para capturar colonias CE puro se utiliza 9. Cada colonia se puede expandir en cultivo durante varios pasajes sin la aparición de contaminantes no comunitario. Este método también produce múltiples clones CE de un único procedimiento de aislamiento, que es ideal para el estudio de endoheterogeneidad telial. Además, se muestra que Cdh5 cre: / l ratones ZsGreen l / s reportero son una valiosa herramienta para la generación de la CE "destino asignada", indelebles, que mantienen ZsGreen fluorescencia en la cultura 10. Con pequeños ajustes en el protocolo, este método debe ser adaptable a diferentes tipos de tumores o tejidos normales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido a las dificultades en la obtención de cultivos puros TEC primaria, muchos estudios in vitro TEC sustituto con las líneas de la CE disponibles comercialmente o CE primaria como la vena umbilical humana CE (HUVEC) 13. Sin embargo, estas poblaciones de la CE de los tejidos normales sólo se pueden servir como sustituto de la TEC que difieren notablemente de sus homólogos normales. Por ejemplo, TEC son fenotípicamente y funcionalmente anormal in vivo y algunas de estas anomalías pued…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
Referências
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