We presenteren een experimenteel protocol naar een ondersteunde lipidebilaag op vaste substraten te vormen zonder gebruik van lipide blaasjes. We tonen een eenstaps werkwijze op een lipide dubbellaag op siliciumdioxide en goud en ondersteunde membranen met cholesterol verrijkte domein voor verschillende biologische toepassingen te vormen.
Om celmembranen na te bootsen, de ondersteunde lipidedubbellaag (SLB) is een aantrekkelijk platform waarmee in vitro onderzoek van membraan-gerelateerde processen, terwijl het verlenen van biocompatibiliteit en biofunctionality aan vaste substraten. De spontane adsorptie en breuk van fosfolipide vesicula is de meest gebruikte methode om SLBs vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, vesicle fusie (VF) is beperkt tot slechts een deel van lipidesamenstellingen en vaste dragers. We beschrijven hier een eenstaps algemene procedure genaamd de oplosmiddelvrije ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) de vorming methode om SLBs die geen vesicles vormen vereist. De SALB werkwijze omvat de afzetting van lipide moleculen aan een vast oppervlak in de aanwezigheid van met water mengbare organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld isopropanol) en daaropvolgende solvent-uitwisseling met waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. De continue oplosmiddel stap uitwisseling maakt de toepassing van deWerkwijze in een doorstroom configuratie geschikt voor bewaking dubbellaagsformatie en daaropvolgende wijzigingen via uiteenlopende oppervlakte-gevoelige biosensoren. De SALB werkwijze kan worden gebruikt om SLBs fabriceren op uiteenlopende hydrofiele vaste oppervlakken, zoals die welke hardnekkig vesikel fusie zijn. Bovendien maakt fabricage van SLBs samengesteld lipidesamenstellingen die niet kunnen worden bereid met de vesicle fusiemethode. Hierin vergelijken we de resultaten verkregen met de SALB en conventionele blaasjes fusiemethoden twee illustratieve hydrofiele oppervlakken, siliciumdioxide en goud. Om de experimentele omstandigheden voor de bereiding van hoogwaardige bilagen bereid via de SALB werkwijze te optimaliseren, is het effect van verschillende parameters, waaronder het type organisch oplosmiddel in de depositiestap de snelheid van uitwisseling van oplosmiddel en de lipide concentratie besproken met probleemoplossingstips . Vorming van ondersteunde membranen die hoge fracties van cholesterol is ook demonencentreerde de SALB methode, aandacht voor de technische mogelijkheden van de SALB techniek voor een breed scala van membraan configuraties.
De vaste drager lipide bilaag 1 (SLB) is een veelzijdig platform dat de basiskenmerken van biomembranen behoudt zoals de dubbellaag dikte, tweedimensionale lipide diffusievermogen, en de mogelijkheid om membraangebonden biomoleculen gastheer. Vanwege de complexiteit van natuurlijke celmembranen, heeft deze eenvoudige platform getoond gefunctioneerd als efficiënt platform in vitro studies membraan processen zoals raft vorming 2, eiwitbinding 3, virussen en virusachtige deeltje bindende 4,5 en cell signaling 6. Gevormd in de nabijheid van een vaste drager, de SLB platform is compatibel met een reeks oppervlak-gevoelige meettechnieken als totale interne reflectie microscopie (TIRF), kwartskristalmicrobalans-dissipatie (QCM-D) en impedantiespectroscopie.
Verschillende werkwijzen zijn ontwikkeld om verschillende soorten SLBs, waaronder luchtbel producereninstorting 7 en dip-pen nanolithografie 8 voor submicron-sized lipide vlekken, spin-coating 9 voor tweelaags stacks en Langmuir-Blodgett (LB) 10 en blaasje fusion (VF) 11 voor full-spanning, enkel lipidedubbellaag coatings. De VF werkwijze omvat de adsorptie van kleine unilamellaire vesicles een vaste drager en daaropvolgende spontane breuk en fusie met een continu lipide dubbellaag vormen. Echter, onder fysiologische omstandigheden, spontane breuk vesikel is voornamelijk bedoeld silicium gebaseerde materialen zoals siliciumdioxide, glas en mica. Bovendien is vesicle breuk niet spontaan blaasjes voor complexe lipide samenstellingen zoals die met hoge fracties van cholesterol of negatief geladen lipiden. Afhankelijk van het systeem kan vesicles scheuren worden geïnduceerd door verdere afstemming van de experimentele condities zoals temperatuur 12, 13 oplossing pH en zoutgehalte 14, osmotische shock 15 </sup> of druk 16 of toevoeging van bivalente ionen, zoals Ca2 + 17. Alternatief kan het membraan-actieve peptide AH worden ingevoerd om een laag geadsorbeerd blaasjes destabiliseren, waardoor scheuren en vesikel bilaag vorming op een reeks oppervlakken 18-22.
Bovendien vereist een succesvolle dubbellaagsformatie bereiding van een goed gecontroleerde populatie van kleine unilamellaire vesicles die tijdrovend en moeilijk te bereiken voor bepaalde membraan preparaten kunnen worden. Daarom, ondanks het hoge rendement optimaal gevallen (bijvoorbeeld na uitgebreide vries-dooi voorbehandeling van vesicles 23), de algemene toepassing van vesikel fusie wordt beperkt door de reikwijdte van geschikte substraten en membraan preparaten.
Werkwijze 24-28-oplosmiddel ondersteunde lipide dubbellaag (SALB) is een alternatieve fabricagetechniek die lipide vesicles niet vereist. De werkwijze berust op de afzetting of lipide moleculen aan een vast oppervlak in aanwezigheid van een water mengbaar organisch oplosmiddel, gevolgd door geleidelijke uitwisseling van deze oplosmiddelen met een waterige bufferoplossing teneinde SLB vorming veroorzaken. Tijdens het oplosmiddel-uitwisselingsstap, het ternaire mengsel van lipiden, organisch oplosmiddel en water ondergaat een serie faseovergangen met toenemende water fractie, wat leidt tot de vorming van lamellaire fase structuren in de bulk oplossing en een SLB op het vaste substraat. Belangrijk is dat deze zelfassemblage route omzeilt de noodzaak van vesicles scheuren, gewoonlijk de beperkende stap voor de transformatie van geadsorbeerde vesicles in een SLB. Het protocol is toepasbaar op diverse oppervlakken zoals siliciumdioxide, aluminiumoxide, chroom, indium tinoxide, en goud. In dit document en de bijbehorende video, wordt de vergelijking van lipideafzetting de SALB en vesicle fusiemethoden gepresenteerd. Met name de invloed van de experimentele criteria zoals lipideconcentratie, Stroomsnelheid, en de keuze van water mengbaar organisch oplosmiddel, de kwaliteit van de bilaag gevormd door de SALB methode besproken. Analytische karakterisering van de vervaardigde SLBs wordt uitgevoerd door de QCM-D, fluorescentiemicroscopie en fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) technieken. QCM-D bewaking is een oppervlakte-gevoelige massa meettechniek die sinds het pionierswerk uitgevoerd door Keller en Kasemo 29, is uitgebreid gebruikt om kwantitatief onderzoek dubbellaagsformatie. Fluorescentie microscopie maakt controle van membraan homogeniteit en de visualisatie van membraandomeinen. De FRAP techniek is een standaard hulpmiddel om de laterale beweeglijkheid van lipide moleculen in een SLB, hetgeen een essentiële eigenschap van vloeibare membranen te bepalen.
Het eerste deel van deze studie omvat QCM-D analyse van de SALB en vesikel fusie methoden toegepast dubbellaagsformatie op siliciumdioxide en goud proberen. In het tweede deel,de bereiding en karakterisering van ondersteunde membranen met verschillende soorten cholesterol concentraties met SALB methode gedemonstreerd en de resultaten vergeleken met die verkregen door het blaasje fusie methode.
In dit werk, wordt een oplosmiddel-uitwisseling protocol voorgesteld waarin lipiden alcohol (isopropanol, ethanol of n-propanol) worden geïncubeerd met een vaste drager en daarna de alcohol geleidelijk vervangen door een waterige bufferoplossing teneinde een reeks drijven van faseovergangen uiteindelijk produceren lamellaire fase lipidendubbellagen 24. Er wordt aangetoond dat de methode kan vervaardigen ondersteunde lipide dubbellagen op oppervlakken zoals goud, die hardnekkig het blaasje fusiemethode.
Een optimale lipide concentratiebereik (0,1-0,5 mg / ml) werd bepaald voor complete vorming dubbellaag in standaard experimentele formats dusver getest. Bij lipide concentraties onder 0,1 mg / ml, discrete microscopische stukken bilagen gevormd. Anderzijds, bij concentraties boven 0,1 mg / ml en lager dan 0,5 mg / ml, is een volledige en gelijkmatige bilaag gevormd. Op lipide concentraties boven deze range, werd een vloeistof bilayer nog gevormd als verificatieed door FRAP analyse echter fluorescentiemicroscopie onthult de aanwezigheid van extra lipidestructuren bovenop de bilaag. Opvallend is dat de morfologie van deze bijkomende lipidestructuren, zoals bepaald met QCM-D analyse, afhankelijk van de alcohol die gebruikt werd tijdens de incubatiestap. In het geval van ethanol, de relatief hoge Δ f en Δ D verschuivingen lijken op de QCM-D signature verkregen voor een geadsorbeerde laag vesicle. Wanneer isopropanol of n-propanol werd gebruikt in de Δ f iets hoger dan de waarde verwacht voor een dubbellaag (laatste Δ f tussen -30 tot -40 Hz), terwijl Δ D was aanmerkelijk hoger. Dergelijke QCM-D reacties te verwachten voor uitgebreide lipidestructuren (bijv wormachtige micellen) buitenwaarts uitsteekt uit het membraanoppervlak (zoals zichtbaar door fluorescentiemicroscopie in sommige gevallen).
De snelheid van de oplosmiddel uitwisseling is een andere belangrijke parameter die kritisch kan zijn, especially bij lagere lipide concentraties (bijvoorbeeld 0,1 mg / ml) gebruikt. Snelle omwisseling oplosmiddel bij lage lipide concentratie kan leiden tot de vorming van incomplete bilagen. In de standaard meetkamer gebruikt voor QCM-D metingen in dit document (Q-Sense E4 meetkamer), debiet van ongeveer 100 ui / min, waren geschikt voor zeer reproduceerbare volledige dubbellaagsformatie. Voor stroom cellen met andere geometrieën en volume, kan de optimale stroomsnelheid variëren en moet empirisch worden bepaald op basis van de hierin voorgestelde maatregelen.
Naast ondersteunde lipide dubbellagen vormen op oppervlakken die hardnekkig vesikel fusie zijn, kan de SALB worden toegepast om de noodzaak van lipide vesicles die kunnen scheuren, waardoor de deur naar de vervaardiging van ondersteunde membranen met complexe samenstellingen omzeilen. Als illustratief voorbeeld samenstelling werden lipidemengsels met een grote fractie van cholesterol onderzocht. Cholesterol is een belangrijke component van Mammalian celmembranen, en zijn fractie kan benaderen 45-50 mol% van het membraan lipide samenstelling (bijvoorbeeld in erytrocyten). Derhalve moet ook een eenvoudig model van een lipide bilaag die een menselijke celmembraan omvatten cholesterol.
Terwijl vesikel fusie kan worden om vloeibare lipide dubbellagen die slechts 10-15% cholesterol fabriceren, kan de werkwijze SALB vorming van vloeibare lipide dubbellagen met een hoog fracties cholesterol (tot 57 mol%, zoals gekwantificeerd door QCM-D metingen) 36. Wanneer echter het cholesterolgehalte verder werd verhoogd (tot 63 mol%) werden domeinen streep-vorm 37 waargenomen. De co-bestaande domeinen vloeistof denken aan die waargenomen in de β regio in het fasediagram van de cholesterol / fosfolipiden monolaag aan het lucht-water grensvlak.
Over het algemeen wordt de SALB methode getoond om een eenvoudige en efficiënte aanpak op ondersteunde lipide bilagen te vormen, met name in gevallen buiten het bereik van de conventionele vesikel fusie methode. Tot nu toe werden de QCM-D techniek en fluorescentiemicroscopie voornamelijk gebruikt om de ondersteunde lipide bilagen gevormd door SALB wijze karakteriseren. Kijken, een breed scala van oppervlakte-gevoelige analytische meettechnieken, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR) 38, atomic force microscopie (AFM) 39,40, Fourier-transformatie infrarood spectroscopie 41, X-ray 42 en neutronen reflectiviteit 43 kan, worden gebruikt voor het verder karakteriseren en studie eenvoudige en complexe configuraties dubbellaag Bereid middels de werkwijze SALB. Deze nieuwe mogelijkheden opent de deur naar een groter aantal wetenschappers die kunstmatige celmembranen kunnen verkennen door gebruik te maken van een eenvoudige en robuuste experimentele protocol.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen erkennen steun van de National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 en NRF2015NRF-POC0001-19), de National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012), en de Nanyang Technological University te NJC
QCM-D silicon dioxide-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
QCM-D gold-coated substrates | QSense AB, Sweden | ||
Q-Sense E4 module | QSense AB, Sweden | ||
Plasma Cleaner, PDC-32G | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-001 (115V) | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375P | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE) | Avanti Polar Lipids | 810150P | |
cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000P | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma | C4555 | |
Isopropanol | Sigma | 673773 | |
Ethanol | Sigma | 459844 | |
n-propanol | Sigma | 279544 | |
Sticky-Slide I 0.1 Luer | IBIDI | 81128 | |
Male elbow 1/8” | Cole-Parmer | 30505-70 | |
Silicon tubing 1.6mm ID | IBIDI | 10842 | |
Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm | IBIDI | 10812 | |
Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump | Ismatec | ||
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 |