A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Det overordnede formål med denne procedure er den hurtige kvantificering af den energi status C. elegans in vivo med henblik på at bruge dette som et slutpunkt i sammensatte screening. Rationalet er baseret på den transgene ekspression af ildflue-luciferase i nematoden C. elegans 1-3 via plasmidet pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Luciferaseenzymet er fusioneret til grønt fluorescerende protein GFP og udtrykkes konstitutivt og ubikvitært i cytoplasmaet (luciferase peroxisom målrettet signal blev fjernet). Dette fører til lysemission når substratet luciferin tilvejebringes eksogent. Som ormen er transparent, kan måles lys i et luminometer som relative lysenheder (RLU). Cellular ATP brændstoffer bioluminescensreaktionen og dets tilgængelighed bestemmer lysniveauer producerede. Følgelig luminometri tilbyder en convenient betyder at vurdere relative ATP niveauer og i forlængelse mitokondriefunktion, da ATP-produktion sker hovedsagelig i mitokondrier. En sammenhæng mellem mitokondriefunktionen og bioluminescens niveauer er blevet påvist tidligere gennem nedregulering af mitochondriale elektrontransportkæde gener og samtidig reduceret lyseffekt. 1
De Bioluminescens stammer genererede blev betegnet PE254 (feIs4) og PE255 (feIs5) 1 (se materialer listen) og kan anvendes i flæng. 3 En række undersøgelser har udnyttet disse sensor stammer til at rapportere om cellulære ATP-niveauer in vivo efter udsættelse for forskellige miljøfremmede kemikalier såsom natriumazid 1, cadmium 2, spildevand slam ekstrakt 3, 5'-fluor-2-deoxyuridin 6, og en tobaksspecifikke nitrosamin 7. Stammerne har også været nyttigt at overvåge virkningerne af eksponering for ultraviolet C-stråling <sup> 8 og virkninger forstyrre mitokondrie respiratoriske kæde funktion. 1,9 En tidlig version af luminescens sensor udtrykker luciferasegenet uden GFP-fusion (PE39) er også blevet anvendt i undersøgelsen af virkningerne af tungmetaller, og af en respiratorisk . afkobler 10 Stammer PE254 og PE255 bære luciferase: GFP-fusion og GFP-fluorescens viste sig at stige proportionalt med nematode masse, der tilbyder en bekvem måde for normalisering af luminescens værdier 6,9 Virkningerne af differencebeløb af orme per brønd kan også være. tages hensyn til ved at inkludere flere tekniske replikater i assayet (minimum 5 brønde pr tilstand). 3
Protokollen giver mulighed for in vivo monitorering af energiniveauer (i modsætning til mere teknisk besværlig in vitro ATP bestemmelser), der muliggør forbindelse screening og repositionering i det fysiologiske forbindelse med en hel multicellular organisme. Proceduren kan udvides til en række genetiske baggrunde ved at krydse kromosomalt integreret transgen i tilgængelige mutantstammer og / eller ved at lukke munden gener ved RNA-interferens; dermed drage fuld fordel af C. elegans som en model organisme. Metoden skal hjælpe med at reducere sent svigt af lægemiddelkandidater fase på grund af mitokondrietoksicitet og yde et bidrag til reduktion af højere dyreforsøg.
Modelorganismen C. elegans giver et stærkt eksperimentelt system. Det er let at dyrke og producerer rigelige genetisk identisk afkom med en 3,5 dagen livscyklus fra æg til voksen gengivelse (via juvenile larvestadier L1 til L4 til). På grund af sin lille størrelse, kan det være hensigtsmæssigt dyrket i 96-brønds plader, hvilket letter forbindelse screening. Vi præsenterer en fænotypisk screening protokol baseret på stammer af C. elegans, der fungerer som in vivo sensorer energiniveauer. 14 Protokollen gælder for alle laboratorier, selv om der kræves en 96-brønds plade luminometer og en steril kabinet. Det er vigtigt at undgå forurening i assays ved anvendelse af god laboratorieteknik. Hvis arbejdet manuelt, det maksimale antal nematoder plader opnåelige er 13 per forsøg tillader afprøvning af 2x 96-brønds plader narkotika og med to køretøjer plader. Repræsentative resultater er præsenteret for mitokondrie kompleks I inhibitoren rotenone, superoxid generator paraquat, citronsyrecyklus mellemliggende oxalacetat og fire forbindelser med kendt ildflueluciferase inhiberende aktivitet. De første to forbindelser førte til et fald i bioluminescens som forudsagt mens oxaloacetat førte til en forbedring, sandsynligvis resultere af større generation af ATP. Oxalacetat datasæt viser også den iboende variabilitet i eksperimenter baseret på ildflueluciferase som en reporter. Mindst tre uafhængige forsøg er tilrådeligt at fastslå robusthed af svarene til ukendte forbindelser.
Inhibering af ildflue-luciferase-aktivitet blev identificeres med et in vitro assay ved anvendelse af et kommercielt kit. 3 en af forbindelserne resulterede i en betydelig stigning i GFP-fluorescens i overensstemmelse med inhibitoren øge niveauet af GFP-mærkede ildflueluciferase ved binding til luciferase enzymets aktive site, og gøre det mere stabilt. 15 I nogle tilfælde(ikke i dette tilfælde) kan føre til øgede niveauer af bioluminescens, når inhibitoren fortrænges af overskud af substrat. 15 Det er derfor vigtigt ikke at fortolke resultater fejlagtigt ud fra forbindelser, der interagerer med ildflue enzym som nedsat eller forøget ATP-niveauer / mitokondriefunktionen. Ændringer i luminescenssignal ganske ofte korrelerer med yderligere målinger af sundhed, såsom bevægelse, udvikling og vækst. Som et eksempel, en forbindelse er en mistænkt luciferase-hæmmer, hvis en dramatisk nedgang i bioluminescens signal findes, men er orme er ikke skelnes fra kontroller ved mikroskopisk observation. En stigning i GFP-fluorescens, kan ikke forklares med vækst eller forbindelse autofluorescens, kan også pege på en inhibitor. En række luciferase hæmmere 15 er kendt og er blevet indgået pubchem. Derfor vil der i første omgang, er det god praksis at konsultere oplysninger om luciferase inhibitorer, som pubchem; efterfulgt af tsante af sammensatte effekter i in vitro-assays med det oprensede enzym 3 og / eller bekræftelse af virkningerne på mitokondriefunktion ved yderligere midler. 16,17
GFP-fluorescens målinger muliggøre påvisning af ildflue luciferase niveauer (og den potentielle opdagelse af nogle luciferaseenzymet hæmmere som diskuteret ovenfor), hvilket gør en stærk sag til måling dette endepunkt sammen bioluminescens hvor det er muligt. Normalisering af bioluminescens aflæsninger til GFP er også et middel til regnskabsmæssig behandling af variationer i orm tal mellem brønde (selv om dette også kan opnås ved inklusion af flere tekniske gentagelser). For større følsomhed, er det vigtigt at trække baggrundsfluorescens fra aflæsninger. Protokollen vurderer bidrag bakteriesuspensionen til baggrunden fluorescens, men nematode autofluorescens ikke tegnede sig for (en begrænsning af den aktuelle analyse, særlig kritisk for enhver aldrende studør givet at nematode autofluorescens stiger med alderen). Autofluorescens af testforbindelser bør også vurderes parallelt. GFP normalisering synes uundværlig hvor forskere ønsker at tilpasse protokol til at sammenligne cellulære ATP puljer i forskellige genetiske mutanter eller efter tavshed af forskellige gener, for at styre for eventuelle strain forskelle på niveauet af ekspressionen af bioluminescens transgen.
Kritiske parametre i protokollen omfatter udviklingsmæssige stadium, hvor eksponeringen initieres, længden af eksponeringen, og opnåelse af et tilsvarende antal nematoder i forskellige brønde. Eksponering kan starte på noget tidspunkt i udviklingen af nematoder, men L3 fase eller ældre er at foretrække. Fra dette tidspunkt på, nematoder afhængige af oxidativ fosforylering til udvikling ind i voksenalderen, hvilket fremgår af en meget betydelig stigning i mtDNA indhold, iltforbrug og ATP-niveauer. 18,19,20 Denne protokol indleder udstillingerure på L4 fase. Årsagen til alikvotere nematoder til 96 brønde kun på dette tidspunkt (i stedet for når de først var forsynet med mad på L1 fase), er, at selv om pladerne placeres i fugtige kamre for at minimere fordampning, en grad af fordampning stadig forekommer i vores rysteinkubator, betragtes som meget små dråber, som dannes på lågene (kan ikke være et problem med andre rystende væksthuse). Ved alikvotere nematoder til plader lige før tilsætning af narkotika standarder, er den faktiske koncentration lægemidlet ikke påvirkes af enhver lille variation i volumen på grund af fordampning. Indlæsning af en nematode plade med køretøjet alene er nyttigt at kontrollere, at nematoder jævnt fordelte mellem brønde. Eventuelle væsentlige forskelle fundet for køretøjet kun pladen ville være tegn på dårlig teknik i dispensering nematoderne til brønde.
Længden af eksponering er en vigtig faktor til at overveje. Hvis virkninger på energi status uafhængigt af væksten er af interesse, proprotokol kan ændres til at rumme kortere eksponeringer (fra næsten øjeblikkelige svar på for eksempel 2 timer). På den anden side, optagelse af forbindelser i C. elegans væv kan tage noget tid. For eksempel 12-24 timer er nødvendige for at opnå maksimale interne koncentrationer af resveratrol og 5-fluor-2'-deoxyuridin (FUDR). 21. Derfor kan en længere eksponering (18 til 24 timer) være berettiget til at maksimere eksponeringsniveauer. Eksponeringstiden bør begrænses til tider, der ikke tillader signifikante niveauer af reproduktion at finde sted i brønden. Vi anbefaler, at den samlede udviklingsmæssige tid af nematoder holdes under 66-67 timer. Selvom praktisk, er nematoder den drægtige ved derefter, og har indledt egglaying. Vi fandt alligevel bioluminescens aflæsninger fra æg forberedelser til at være ubetydelig (ikke vist). Den sur-5-promotor drevne transgenekspression er først opdaget to til to og en halv timer efter befrugtningen på 100 celletrin 22 og Chitinous æggeskal vil kunne begrænse indtrængen af luciferin. Andre har fundet, at befrugtede æg ikke bidrog væsentligt til metabolisme drægtige voksne. 23. Dog betingelser giver mulighed for betydelige afkom produktion skal undgås. Hvis man foretrækker, kan den eksperimentelle tidsskala forskydes tilbage: Vi har tidligere igangsat udsættelse for en miljømæssig toksin på det sene L3 larvestadiet (36 timer) og udført bioluminescens og GFP målinger ved 55 t 2 Alternativt genetiske baggrunde, der er betinget sterile. kan anvendes til at forhindre afkom produktion, som for eksempel fer-15 (B16) II; five-1 (hc17) IV dobbelt mutant, som kan opretholdes ved 15 ° C, men er sterilt ved 25 ° C. 24. Anvendelse af FUDR at inducere sterilitet anbefales ikke, da dette i sig selv kan påvirke nematode metabolisme. 25 Assayet kunne også udføres i stammer med mere permeable neglebånd såsom delvis tab af-funktionion bus-8 mutanter som er multidrug-følsomme på grund af øget permeabilitet af narkotika. 26. Dette vil lette kortere eksponeringer og lavere sammensatte koncentrationer. Betingelserne for at tilføje luciferin til disse nematoder kan også være nødvendigt at justere dvs 1% DMSO og 0,05% Triton-X100 i luminescens bufferen ikke være forpligtet til at forbedre luciferin tilgængelighed.
Protokollen anvender 1% DMSO som køretøjet for forbindelse levering. Selvom det ikke er dødelig, denne koncentration af DMSO har nogle biologiske virkninger, som vi har diskuteret i en tidligere publikation. 3 Mange af de tilgængelige lægemidler biblioteker fremstilles i 100% DMSO, ved koncentrationer, som vil være egnet til cellebaserede assays efter fortynding af køretøjet til 0,1%. Højere sammensatte koncentrationer nødvendige for at fremkalde reaktioner i C. elegans sammenlignet med humane celler, således at det ofte ikke er muligt at gennemføre assays på mindre end 1% DMSO. Igen, anvendelsen af stammer medmere permeable neglebånd kan føre til testning med lavere koncentrationer af køretøjet. Koncentrationer af DMSO højere end 1% anbefales ikke.
Et sæt inkubationstid med luciferin før aflæsninger skal overholdes. Som tidligere vist, luminescens når sin maksimale niveauer i det andet minut efter tilsætning luciferin, forbliver relativt stabil i de første 5 minutter, efterfulgt af en langsom gradvist fald i luminescens løbet af de næste 30 minutter 1. Kinetiske reaktioner på et bestemt kemikalie kan udføres i løbet af denne første fase af 30 minutter efter første dosering af luciferin.
Protokollen indebærer en sult skridt efter indsamling af æg for at opnå synkronisering af nematoden befolkning. Vi anbefaler synkronisering af nematodeforsøget populationer da forskellige udviklingsstadier afviger i cellulære ATP-niveauer og kan reagere forskelligt på testforbindelserne. Ved at udføre sult i S kompletmedium i modsætning til M9, er skraveringen nematoder forsynet med en carbonkilde (ethanol), således at larverne ikke udvikler, men er ikke helt udsultes. 27,28 Det er også blevet vist, at standset L1 s er primet for hurtig reaktion på fødevarer og normal L1 vækstrate opnås inden 3 timer efter et måltid bliver tilgængelig. 29 Men det muligheden for, at sult trin kan ændre metabolismen af C. elegans kan ikke udelukkes. 30 Af denne grund længden af sult bør ikke overstige 24 timer (18 timer er tilstrækkelig til synkronisering). Visse laboratorier kan have mulighed for at bruge en Copas Biosorter for alder synkronisering uden om sult skridt helt. Andre laboratorier kan har en præference for at udvide nematode befolkning på faste medier (NGM plader med OP50) før blegning (trin 3.1), og dette vil fungere godt også. Vi bruger S mediet under sammensatte eksponering som en standard medium for nematode dyrkning, However kan vælges andre medier, for eksempel K medium eller EPA moderat hårdt vand er ofte brugt til økotoksikologiske undersøgelser. 31,32
Protokollen giver et middel til at screene og identificere kandidater til yderligere test i form af virkningerne på mitokondriefunktionen. På tidspunktet for den primære screening er det sandsynligt, at nogle forbindelser vil være blevet nået på grund af kun én koncentration, der testes, således lægemiddelscreeninger bør ikke betragtes som udtømmende. Hits kan valideres ved brug af teknikker til vurdering forskellige aspekter af mitokondrie-funktion for eksempel iltforbrug, C. elegans stammer med GFP udtrykke mitokondrier, pletter for mitokondriemembranpotentiale og / eller ROS målinger. 16,33,34 den største betydning af metoden er at have et middel til screening af store antal forbindelser og / eller betingelser på flercellede organismal plan, og vigtigere at være i stand til at drage fordel af the genetisk sporbarhed C. elegans at undersøge virkningsmekanismer. Teknikken kan bidrage til at fremskynde og finde nye veje til opdagelsen af interessante forbindelser og mål. Det forudses, at kombinationen af føleren med genetiske baggrunde forbundet med human sygdom til screening af sammensatte biblioteker i en sygdom relevant sammenhæng vil have meget at tilbyde.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
E. coli OP50 | CGC | ||
General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |