Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) para intracelular Segmentação Aplicações

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Veículos de entrega baseado em nanopartículas têm mostrado uma grande promessa para aplicações dirigidas intracelulares, fornecendo um mecanismo para alterar especificamente sinalização celular e expressão gênica. Estes veículos podem ser carregados com medicamentos, proteínas, ácidos nucleicos e concebidos para influenciar as respostas celulares e conseguir um efeito desejado em tecidos-alvo. Muitos tipos de nanocarriers têm sido exploradas para benefício terapêutico e de diagnóstico, incluindo lipidos, polímeros, silício e materiais magnéticos. Estes sistemas são atraentes devido ao seu potencial para a entrega da droga localizada, aumento da concentração terapêutica em tecidos-alvo e redução de toxicidade sistêmica.

Nanopartículas de lípidos sólidas (NLS) são um exemplo bem estudado de um sistema de entrega de nanopartículas que surgiu como um veículo de entrega de droga promissora nos últimos anos. SLNs pode ser facilmente formulado para várias aplicações, incluindo bio-sensor ^1, cosméticos ^2, e tentrega herapeutic ^3-7. A sua utilidade advém do facto de que eles são constituídos inteiramente de reabsorvíveis, lípidos não tóxicos, resultando em melhor biocompatibilidade. Durante a síntese, os fármacos lipofilicos podem ser incorporados em veículos SLN, aumentando assim a solubilidade do fármaco e da aptidão para administração parentérica. SLN veículos também ajudam a estabilizar terapêuticas encapsuladas, reduzindo sua degradação e depuração, e maximizando a ação terapêutica. Estes veículos são particularmente bem adequados para longa actuação, preparações de libertação controlada devido à sua estabilidade à temperatura do corpo ^3,4,8,9. Importante, a encapsulação de fármacos em nanopartículas de lípidos altera os perfis farmacocinéticos intrínsecas das moléculas de fármaco. Isto proporciona uma vantagem potencial de permitir a libertação controlada de fármacos com um índice terapêutico estreito. A taxa de libertação de agentes terapêuticos incorporados-NLS pode ser regulado com base na taxa de degradação do lípido ou a taxa de difusão da droga namatriz lipídica.

SLNs são muitas vezes modificados para se acumular nos tecidos alvo específicos. Por exemplo, o tamanho (tipicamente maior do que 10 nm) potencia a retenção na circulação, em que a vasculatura de tecido tumoral gotejante facilita a deposição. Além disso, a via de administração da partícula foi mostrado para alterar a biodistribuição com o potencial para segmentar estruturas fisiológicas específicas tais como os nódulos linfáticos ^10,11. Após a deposição nos tecidos alvo, conseguindo interacções celulares apropriados e eventual internalização de nanopartículas é um desafio devido à capacidade das membranas celulares para controlar selectivamente o fluxo de iões e moléculas para dentro e para fora da célula ^12. Para facilitar a absorção celular, é possível modificar nanocarriers com ligandos específicos, incluindo péptidos, moléculas pequenas, anticorpos monoclonais e ^13,14. Vários mecanismos incluindo tanto passiva penetração e transporte activo de nanopartículasatravés da membrana celular foram previamente descritos ^3,12,15. Em geral, demonstrou-se que as interacções célula-nanopartículas são influenciadas pelas propriedades físico-químicas das nanopartículas, incluindo o tamanho, forma, carga de superfície e a química de superfície, além de parâmetros específicos de células, tais como tipo de célula ou a fase do ciclo celular ^12.

Uma investigação anterior demonstrou a síntese de sub-10 SLNs nm para ¹⁶ tópicos e aplicações de detecção de biomarcadores ¹ utilizando o método de ¹⁷ temperatura de inversão de fase (PIT). Este é um método de síntese ² suave onde a composição permanece constante enquanto a temperatura é gradualmente alterado. Agitação contínua da solução aquecida, à medida que arrefece a resultados de RT em uma nanoemulsão. Este processo resulta na síntese de NLS com tamanho de partícula menor do que ¹ relatado anteriormente usando vários métodos para a síntese do lípido nanoparticles ^17-22. A escala de tamanho resultante, menos de 20 nm, proporciona uma vantagem para aplicações de segmentação intracelulares devido ao aumento da área superficial eo potencial para interações celulares avançados.

Um esquema de NLS, concebido para proporcionar um corante fluorescente ou terapêutico, é mostrado na Figura 1. Os SLNs consistem de um lípido interior (por exemplo, alcano linear), que permite a incorporação de compostos lipófilos (por exemplo, corantes ou agentes terapêuticos) e um exterior surfactante (surfactante não iónico por exemplo, linear) rodeada por água. Neste estudo, SLNs foram carregadas com um corante fluorescente e utilizado como um modelo para investigar interacções célula-partículas. Fibroblastos dérmicos humanos primários e células dendríticas de rato foram expostos a corante carregado-NLS ao longo do tempo, a fim de caracterizar as interacções com respeito à toxicidade e a absorção das partículas. Um grupo 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) foi utilized, a fim de estabelecer níveis de dosagem adequados. A microscopia de fluorescência e citometria de fluxo foram utilizados dois métodos para analisar a absorção de partículas in vitro.

Figura 1. Esquema da SLN mostrando os principais constituintes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Processamento de SLNs Síntese de SLNs Nota: Use o método PIT 1,17,20 para preparar os sub-20 SLNs NM 1. Utilizar técnicas assépticas, biorreagentes ou reagentes de grau de cultura de células, e materiais estéreis (isto é, pipetas, espátulas, ampolas, etc.). Usar uma cabine de segurança biológica para a síntese de NLS (Figura 2). Combinar 0,6 mg de corante fluorescente (Vermelho do Nilo (NIR), a concentra…

Representative Results

O método PIT foi utilizado para sintetizar os NLS e a temperatura de inversão de fase foi determinada utilizando um banho de água. As amostras foram aquecidas lentamente e agitado suavemente até que a solução apareceu clara. A temperatura de inversão de fase para as SLNs feitas usando heneicosano lipídica é de 45 ° C. A Tabela 1 sumariza o tamanho de partícula, polidispersão, ponto de fusão e do calor latente de fusão para os NLS. Os NLS sintetizados utilizando as condições de processame…

Discussion

Neste estudo, a síntese de NLS e a sua aplicabilidade para aplicações destinadas intracelulares foram exploradas. Estas nanopartículas biocompatíveis têm mostrado promissores como veículos de entrega para várias aplicações, incluindo a entrega de drogas, o silenciamento do gene, e tecnologias de vacina ^25-30. Ultra-pequenas SLNs foram sintetizados usando um processo fácil, e as suas interacções com células epiteliais primárias e células imunitárias primárias foram exploradas. SLNs foram conc…

Materials

Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo	—-	Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	—-	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	R&D Systems	415	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	R&D Systems	404	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.