En Label-fri teknik til Spatio-temporale Imaging af encellede Sekret

Summary

Inter-cellulær kommunikation er kritisk for styring af forskellige fysiologiske aktiviteter i og uden for cellen. Dette papir beskriver en protokol til måling af spatio-temporale karakter af encellede sekreter. For at opnå dette, er en tværfaglig tilgang, der anvendes som integrerer label-fri nanoplasmonic sensing med levende celle billeddannelse.

Abstract

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.

In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.

A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Introduction

Inter-cellulær kommunikation er afgørende for reguleringen af ​​mange fysiologiske aktiviteter både i og uden for cellen. En række proteiner og vesikler kan udskilles som efterfølgende udløse komplekse cellulære processer, såsom differentiering, sårheling, immunrespons, migration og proliferation. ^1-5 Fejl af inter-cellulære signalveje er blevet impliceret i en lang række lidelser, herunder cancer, aterosklerose og diabetes, for at nævne et par stykker.

Den optimale celle sekretion assay bør være i stand til rumligt og tidsligt kortlægge udskilt protein af interesse uden at forstyrre de relevante signalveje. På denne måde kan udledes årsagssammenhænge mellem koncentrationen profiler og respons de modtagende celler. Desværre har mange af de mest almindeligt anvendte fluorescerende teknikker ikke opfylder disse kriterier. Fluorescerende fusionsproteiner kan anvendes til at mærke analytten wnden for cellen, men kan forstyrre den sekretoriske pathway, eller hvis udskilt, resulterer i en diffus glød uden for cellen, som er vanskelig at kvantificere. Fluorescerende immunosandwich-baserede assays er de mest almindeligt anvendte teknikker til påvisning af cellulær sekreter, men kræver typisk isolering af individuelle celler. ^6-11 Hertil kommer, at indførelsen af sensing antistof typisk stop eller slutter eksperimentet og størrelsen af antistof etiketter, 150 kDa for IgG, er en hindring for nedstrøms signalering.

På grund af disse forhindringer er det at foretrække, at en etiket-fri teknik anvendes til at afbilde protein sekreter og blandt eksisterende label-free teknologier, overfladeplasmonresonans (SPR) og lokaliseret overfladeplasmonresonans (LSPR) sensorer er fremragende kandidater. ^12-17 Disse sensorer er ofte blevet brugt til analytbindingsmiddel studier af proteiner, exosomer og andre biomarkører. ^18-24 I tilfælde af LSPR den plasmoniske nanostructures kan mønstrede litografisk på dækglas og ophidset ved hjælp af synligt lys via standard wide-field mikroskopi konfigurationer. På grund af deres nanoskala fodaftryk, størstedelen af glassubstratet er tilgængelige for almindelige billedteknik såsom lysfeltsbillede og fluorescensmikroskopi gøre disse prober velegnet til integration med live-cell mikroskopi. ^25-28 Vi har vist realtid måling af antistof sekreter fra hybridomaceller hjælp funktionaliseret guld plasmoniske nanostrukturer med rumlige og tidslige resolutioner 225 msek og 10 um, hhv. Den grundlæggende chip konfiguration er illustreret i figur 1. ²⁸ udgangslysvej af mikroskopet er delt mellem et CCD-kamera anvendes til billeder og en fiber-optisk koblet spektrometer til kvantitativ bestemmelse af fraktioneret belægning af et bestemt opstilling af nanostrukturer (figur 2 ).

Den protocol præsenteres i dette papir beskriver den eksperimentelle design til real-time måling af encellede sekreter samtidig overvåger cellernes reaktion ved hjælp af standard lyse-felt mikroskopi. Den tværfaglige tilgang omfatter fremstilling af nanostrukturer, funktionalisering af nanostrukturer til høj affinitet binding af analytter, overflade optimering for både at minimere ikke-specifik binding og karakterisering kinetiske hastighedskonstanter anvendelse af et kommercielt overfladeplasmonresonans (SPR) instrument, integration af cellelinier på substratet, og analyse af billeder og spektrale data. Vi forventer denne teknik for at være en nødvendig teknologi for spatio-temporale kortlægning af celle sekreter og deres årsagssammenhænge med som får celler.

Protocol

1. nanostrukturer Fabrication Vælg 25 mm dækglas med en omtrentlig tykkelse på 170 um (1,5 No.) som substrater for nanofabrikation. Fordybe dækglassene i Piranha-opløsning (3: 1-forhold mellem svovlsyre og hydrogenperoxid) i mindst 6 timer. Vask Piratfisk gennemblødt dækglasset med rigelige mængder ultrarent 18,2 MQ deioniseret destilleret vand (DDW). ADVARSEL: Piranha syre reagerer voldsomt med organiske materialer og skal håndteres med største omhu. Deposit 10 nm chrom tynd film på dækglassene med e-beam fordampning for at undgå charge virkninger under mønsterdannelse og billeddannelse af nanostrukturer. Spin det første lag af dobbeltlag modstå bestående af ethyllactat methylmethacrylat (MMA_EL6) copolymer ved 2.000 rpm i 45 sek og derefter bages ved 150 ° C. Spin det andet lag af poly-methylmethacrylat (950PMMA_A2) ved 3.000 rpm i 45 sek derefter bages ved 180 ° C. Pattern dobbeltlaget modstå hjælp af elektronstrålelitografi (EBL) ved 25 kV med en dosis på 300 pC / cm2. Udvikle sig i isopropylalkohol (IPA) / methylisobutylketon (MIBK): 2/1 og skyl i IPA. Deposit Ti (5 nm) / Au (80 nm) film på substratet ved hjælp af en e-beam fordamper. Efter guldet deposition, løft copolymer dobbeltlag modstå ved opblødning substratet i acetone i 4 timer. Undersøg underlaget ved hjælp af scanning elektron mikroskop (SEM) for at bekræfte nanostruktur form og størrelse, skal du fjerne den resterende krom fra underlaget via våde etch hjælp CR-7 ætsemiddel i 60 sekunder ved stuetemperatur, og derefter skylles i DDW. Design en center-til-center vifte afstand på 33 um at give plads til cell imaging mellem arrays. Mønster af nanostrukturer i 20 x 20 mønster for hvert array med en deling på 300 nm ved hjælp af en e-beam forfatter. Hver chip indeholder 300 arrays med en typisk nanostruktur dimension på 80 ± 2,5 nm højde og 70 ± 2,5 nm Diameter. Undersøg en delmængde af arrays ved hjælp af atomic force mikroskop (AFM) til kontrol af størrelse og ensartethed. Vedhæfte en bærering, typisk silicium, på bagsiden af ​​dækglasset ved anvendelse af en UV hærdende epoxy. 2. Chip Rengøring og anvendelse af Self-samlet monolag Til rengøring og regenerere chips, plasma aske ved en effekt på 40 W i en 300 mTorr blanding af 5% brint, 95% argon i 45 sek efter rengøring kammeret i 5 min under de samme betingelser. Funktionalisering af guld nanostrukturer umiddelbart efter plasmaforaskning ved at nedsænke chip i en to-komponent ethanolisk thiolopløsning bestående af en 3: 1-forhold mellem SH- (CH2) 8 -eg 3-OH (SPO) og en komponent med enten en amin eller funktionel carboxylgruppe, nemlig SH- (CH2) 11 -eg 3-NH2 (SPN) eller SH- (CH2) 11 -eg 3 -COOH (SPC). Lad chip in thiolopløsning O / N til dannelse af en selv-samlet monolag (SAM). Skyl chip med ethanol og tør med nitrogengas. Hvis det er nødvendigt, opbevares den funktionaliserede chip i op til 2 uger ved 4 ° C. Når den er klar til brug reagerer SPN eller SPC komponent med liganden ved hjælp af en kemi afhængigt af liganden af ​​valg (se nedenfor). Bemærk: De chips kan regenereres og genindførte funktionaliserede dusinvis af gange. En given chip kan bruges i perioder, der spænder fra 6 måneder til over et år. Spektrene målt på et bestemt opstilling er pålideligt gengivet efter gentagne regenereringer af plasmaforaskning, efterfulgt af biofunctionalization. 29 3. Overflade Funktionalisering og Kinetic karakterisering Bemærk: Anvend den funktionaliserede chip i den kommercielle SPR instrument til at karakterisere de kinetiske hastighedskonstanter mellem liganden og analytten, samt at undersøge modstand SAM til uspecifik bBINDENDE. Der er en bred vifte af strømningshastigheder og mikrofluide design, der giver mulighed for effektiv overfladefunktionalisering. Da vi har en kommercielt tilgængelig SPR vi standardiseret omkring de anbefalede flow. Vi bemærker, at disse strømningshastigheder er typiske for alle SPR instrumenter og så er ikke restriktive. SPR instrument er ikke en nødvendighed, da alle funktionalisering kan udføres direkte på LSPR chippen, men det reducere vores arbejdsbyrde, fordi det er en multiplex instrument mens vores LSPR mikrofluid setup er det ikke. Funktionalisere en kommerciel nøgne guld chip med SAM, som beskrevet i afsnit 2. Hvis der anvendes et SPC baseret SAM, aktivere carboxylgruppen med en 1: 1 blanding af 133 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) og 33 mM N-hydroxysuccinimid (NHS) i DDW i 10 min. Konjugere den aktiverede carboxylgruppe med antistoffet / ligand af interesse for 300 sek under anvendelse af en strømningshastighed på 30 ul / min. Forbered liganderne ipH 6 phosphatbuffer, typisk, men dette kan variere afhængigt af molekylet. Efter liganden konjugering, flow 0,1 M ethanolamin i phosphatbufret saltvand (PBS) som et deaktivator skridt for 300 sekunder ved en hastighed på 30 ul / min. Ethanolamin hjælper med at minimere den ikke-specifikke binding. Indføre analytten af ​​interesse ved en strømningshastighed på 100 ul / min ved hjælp af en række koncentrationer og beregne de kinetiske hastighedskonstanter anvendelse af en kinetisk analyse software. Hvis ikke-specifik binding er problematisk, øge forholdet mellem SPO til SPC eller SPN. 4. LSPR Generelle indstillinger Mikroskop indstillinger: Brug en 100 W Halogen lampe til Koehler belyse prøven. Brug en lang pasning filter (typisk 593 nm cutoff) i lyset vej til at fjerne bølgelængder, der ikke bidrager til resonans shift (figur 2). For LSPRi dataindsamling, skal du bruge et omvendt mikroskop med en 40X olie immersion mål (1,4 NA) og en termoelektrisk afkølet 16 bit CCD-kamera. Placer en stråledeler ved udgangsporten af ​​mikroskopet for at opnå Imagery and spektre samtidigt. Indstil temperaturen mikroskop scenen til 37 ° C og henstår i 4 timer. Indarbejd en ekstra inkubation forsamling på mikroskopet at regulere CO2-koncentration og fugtighed ved 5% og 95%, hhv. Chip forberedelse og montering: Funktionalisere den LSPR chip som beskrevet i afsnit 2 med de optimale tokomponent SAM-forhold bestemmes ud fra SPR eksperimenter. Indlæse chippen inden en skræddersyet microfluidic holder som følger. Placere chip på en aluminium bundstykke. Sandwich chippen mellem dette nederste stykke og en silikonepakning og en klar plast topstykke. Brug 4 skruer til at klemme samlingen. For en typisk SPC-baserede thiol program, drop coat 300 pi af en 1: 1 blandingtur på 133 mM EDC og 33 mM NHS i DDW at aktivere carboxylgrupper i produktresuméet thiol komponent. Vent i 10 minutter og manuelt skylles overfladen med 10 mM PBS. Konjugere den aktiverede carboxylgruppe med liganden (typisk et antistof eller antistoffragment) af interesse for dråbe coating 300 pi ligand-løsningen. Vent i 30 minutter og manuelt skylles med 10 mM PBS. Drop coat 300 pi 0,1 M ethanolamin i PBS på chippen for at minimere uspecifik binding. Vent i 10 min. Vask ethanolamin med PBS indeholdende 0,005% Tween 20 (PBS-T20). Læg et kvarts stykke over chippen til at mindske udsving i data relateret til en skiftende menisk. Hold chip våd med PBS-T20-buffer, mens montering på mikroskop. Placer LSPR chip forsamling fast i den opvarmede fase prøveholderen og vedhæfte mikrofluid slanger. Fastgør mikrofluidik slangen til montage og flow buffer (eller serum frie medier til celle studier), indtil en stabil tilstand er nået. Lad montering og mikroskop for at ækvilibrere i mindst 2 timer. Juster chip bruger joystick, så den centrale matrix flugter med fiberoptiske for spektroskopi. Spektroskopiske data er taget ved hjælp af et spektrometer og spektralanalyse software. Hold arrays i fokus under hele forsøget ved hjælp af software autofokus, Zeiss Definite Focus eller tilsvarende autofokus enhed. 5. LSPR Imaging af anti-c-myc sekret fra 9E10 hybridomceller Bemærk: Hybridomacellelinien anvendt til denne undersøgelse udtrykker anti-c-myc antistof konstitutivt og dermed ikke kræver en kemisk udløser Funktionalisering af nanostrukturer med c-myc-peptid. Dette har en KD-værdi på 1,77 nM for de anti-c-myc antistoffer secerneret af klon 9E10 hybridomceller. Kultur hybridomacellerne i complete vækstmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika i en T75-kolbe ved 37 ° C under 5% CO2. Opretholde en celledensitet på 4 x 10 5 celler / ml. For cellen sekretion undersøgelser, pellet celler fra T75 kolbe ved centrifugering, vaskes to gange med RPMI-1640 serumfrit medium (SFM) for at fjerne de udskilte antistoffer og justere celledensiteten til 4 x 10 6 celler / ml. Høst cellerne og test for bæredygtighed, inden de videre til LSPR chips. Indføre 50 pi af celleopløsningen manuelt på LSPR chips med en mikropipette. Efter få minutter 25 til 50 celler klæbe til overfladen af ​​LSPR chips. Vaske væk de resterende celler i opløsning med frisk SFM hjælp mikrofluid perfusion system. Vælg LSPR arrays til billedbehandling, som ligger tæt, inden for 10 um, men ikke overlapper med cellerne. For at sikre, at signalet er specifikt for det udskilte anti-c-myc ANTIBodies indføre cellekulturmediet med og uden tilstedeværende antistoffer samt med de antistoffer, men med deres bindingssteder blokeret ved tilstedeværelsen af ​​en mættende koncentration af c-myc-peptid i opløsningen. Kalibrere sensorerne ved slutningen af ​​hver kørsel med en mættende opløsning af anti-c-myc antistoffer (250 nm). Dette hjælper med at normalisere reaktion af sensorerne og bestemme fraktioneret belægning baseret på biofunctionalization profil hver kørsel. Ret afdrift i X og Y-retningen ved hjælp af billede justering software.

Representative Results

I en typisk levende celle sekretion undersøgelse der er flere former for dataindsamling, der finder sted. Figur 3 viser en overlejring af et LSPRi billede, som fremhæver de firkantede arrays, og en transmitteret lys belyst billede, som fremhæver cellen ved nederste venstre. Data typisk indsamlet over en 3-timers periode efterfulgt af indførelsen af ​​en mættende opløsning af analysanden til normalisering beregning beskrevet nedenfor. Fluorescens billeder kan også integreres i dataindsamlingen rutine ved den automatiserede omskiftning af et filter terning. I figur 4 en celle farvet med det fluorescerende farvestof rhodamin membran DHPE udviser lamellipodia-lignende forlængelser (pile). Hvis sådanne forlængelser skulle overlapper arrays de ville give en falsk-positive for protein sekretion. At have flere former for billedsprog kan hjælpe med at identificere sådanne hændelser. Figur 5 viser spektrometri data, før og agterER indførelse af en mættende opløsning (400 nM) kommercielt indkøbt anti-c-myc antistoffer mod c-myc funktionaliserede arrays. Ingen celler var til stede i dette forsøg. Spektret viser både et rødt skift og en stigning i intensitet. Forskellen mellem arealerne under de to kurver resulterer i en stigning i arrayet billedintensiteten i LSPRi tilstand på CCD-kameraet. En ikke-lineær mindste kvadraters analyse af data fremgangsmåde er blevet udviklet til at udlede fraktioneret belægning af overfladebundne ligander fra spektrene. 30,31 Ved afslutningen af forsøget, de mættede intensitetsværdier (dvs. fraktioneret belægning ≈ 1) anvendes til at beregne en normaliseret respons for hver opstilling ved hjælp af følgende formel: Hvor er den normaliserede intensitet på tidspunkt t, oprindelige intensitet ved begyndelsen af forsøget, endelige mættet intensitet og måles intensiteten af arrayet på tidspunkt t </em> hhv. Normaliserede værdier fra to arrays er vist i figur 6. En matrix var inden for 10 um af cellen under undersøgelsen, mens den anden, anvendt som kontrol, var en afstand på 130 um fra cellen. Den pludselige stigning i det normaliserede respons af array tættest på cellen i forhold til den flade af kontrolsystemet array er tegn på en lokaliseret burst af secernerede antistoffer. Figur 1. Sensor design. En tegning, der viser geometrien af en typisk levende celler sekretion eksperiment. Cellen (blå sfæroid) aflejres på LSPR chip, som indeholder rækker af biofunctionalized guld nanostrukturer. I zoomet-i betragtning, cellen sekretion af interesse, i dette tilfælde antistoffer vist som Y-formede molekyler, måles som de binder til overfladenaf de funktionaliserede nanostrukturer. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Optisk opsætning. Det oplyste lys fra en halogenlampe først filtreret af en lang pasning filter (LP). Lyset lineært polariseret (P1) og belyser prøven via en 40X / 1.4 NA mål. Det spredte lys opsamles ved målet og ledes gennem en krydset polarisator (P2). En 50/50 stråledeler (BS) indsættes i det opsamlede lysbanen til samtidig spektroskopiske og billedanalyse. Top højre:. En atomic force mikroskopi billede af 9 individuelle nanostrukturer adskilt af en stigning på 300 nm Klik herfor at se en større version af dette tal. Figur 3. Levende Cell LSPRi Study. Et fusioneret transmitteret lys og LSPRi billede, der viser en enkelt hybridomacellelinie (nederst til venstre) omgivet af 12 arrays. Dette er en kontrast forbedret billede. Scale bar er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4. Levende cellefluorescens Study. En fluorescerende falske farvebillede af en enkelt hybridomacellelinie farvet med rhodamin DHPE, som er en membran farvestof. I fluorescerende billedbehandlingstyper arrays er generelt ikke synlige, men en nærliggende array er observerbare her som abmangler firkant i nederste højre hjørne. Cellen kan ses at blive adskilt fra arrayet selv tentakel-lignende forlængelser (evt filopodia eller lamellipodia) strækker sig udad fra cellerne (pile). Scale bar er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5. Spectral modalitet. Den opnåede spektre fra en c-myc funktionaliseret matrix før og efter indførelsen af 400 nM opløsning af anti-c-myc antistoffer. Ingen celler var til stede i denne undersøgelse. Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 6" src= "/ files / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg" /> Figur 6. Single Cell sekretion. Svaret fra et array beliggende inden for 15 um af en enkelt celle og en placeret 130 um væk (Control). Scale bar er 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.^7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.

There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.

The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.³³ Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.

Materials

25mm diameter glass coverslips	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate	Microchem	PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate	Microchem	MMA EL6
Electron beam evaporator	Temescal	FC-2000
Electron beam lithography	Raith	Series 150
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Acetone	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 chromium etchant	Cyantek	CR-7
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 55
Atomic force microscope	Veeco	Nanoscope III
Plasma ashing system	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system	Biorad	XPR36
Bare gold chip	Biorad	GLC chip	Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo	24510
Pentylamine-Biotin	Thermo	21345
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraavidin	Thermo	31000
Phosphate buffered saline	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Inverted microscope	Zeiss	Axio Observer	Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera	Hamamatsu	Orca R2	Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc peptide HyNic Tag	Solulink	SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody	Sigma-Aldrich	M4439
Hybridoma cell line	ATCC	CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Serum free media RPMI 1640	Invitrogen	11835-030
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Rhodamine DHPE	Life Technologies	L-1392