Intercellulaire communicatie kritisch om diverse fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Dit document beschrijft een protocol voor het meten van de ruimtelijke en temporele karakter van enkele cel afscheidingen. Om dit te bereiken, is een multidisciplinaire aanpak waarin label-free nanoplasmonic sensing met live-cell imaging integreert.
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
Intercellulaire communicatie is cruciaal voor de regulering van vele fysiologische activiteiten binnen en buiten de cel. Een verscheidenheid van eiwitten en vesicles kan worden afgescheiden, die vervolgens leiden tot complexe cellulaire processen, zoals differentiatie, wondgenezing, immuunrespons, migratie en proliferatie. 1-5 Storingen van inter-cellulaire signaalroutes zijn betrokken bij vele ziekten zoals kanker, atherosclerose en diabetes, een paar te noemen.
De optimale celsecretie assay moet in staat zijn ruimtelijk en temporeel kaart brengen uitgescheiden eiwit plaats zonder verstoring van de betreffende signaalwegen. Zo causale verbanden tussen de concentratieprofielen en de reactie van de ontvangende cellen kunnen worden afgeleid. Helaas zijn veel van de meest algemeen gebruikte fluorescentie-gebaseerde technieken niet aan deze criteria. Fluorescent fusie-eiwitten kunnen worden gebruikt om de analyt te taggen winnen de cel maar kan de secretieroute verstoren of uitgescheiden, leidt tot een diffuse gloed buiten de cel die moeilijk te kwantificeren. Fluorescerende-immunosandwich gebaseerde assays zijn de meest gebruikte technieken voor het detecteren cellulaire afscheiding maar vereisen typisch isolatie van afzonderlijke cellen. 11/06 Bovendien is de invoering van de detectie antilichaam kenmerkend stopt of beëindigt het experiment en de omvang van het antilichaam labels, 150 kDa voor IgG, is een belemmering voor de downstream signalering.
Vanwege deze wegversperringen het de voorkeur dat een labelvrije techniek worden toegepast om het eiwit afscheidingen en tussen bestaande labelvrije technologieën, oppervlakte plasmon resonantie (SPR) en sensoren gelokaliseerd surface plasmon resonance (LSPR) zijn uitstekende kandidaten. 12-17 Deze sensors zijn op grote schaal gebruikt voor het analyt bindingsstudies van eiwitten, exosomes en andere biomarkers. 18-24 Bij LSPR, de plasmonische nanostructures kan lithografisch worden gevormd op dekglaasjes en enthousiast met behulp van zichtbaar licht via een standaard wide-field microscopie configuraties. Door hun nanoschaal voetafdruk, het merendeel van het glazen substraat voor algemeen beeldvormingstechnieken zoals helder-veld en fluorescentiemicroscopie maken van deze probes zeer geschikt voor integratie met levende cellen microscopie. 25-28 We hebben de real-time metingen aangetoond antilichaam afscheiding uit hybridoomcellen met gefunctionaliseerde goud plasmonische nanostructuren met ruimtelijke en temporele resoluties van 225 msec en 10 micrometer, respectievelijk. De basis chip configuratie is de figuur 1. 28 De uitgang lichtweg van de microscoop wordt verdeeld tussen een CCD-camera gebruikt voor beelden en een vezel-optisch gekoppelde spectrometer voor de kwantitatieve bepaling van fractionele bezetting van een bepaalde reeks nanostructuren (figuur 2 ).
De protocol in dit document beschrijft de experimentele opzet voor het real-time meting van één cel afscheiding tegelijkertijd bewaken van de respons van de cellen met behulp van de standaard licht-microscopie. De multidisciplinaire aanpak omvat de vervaardiging van nanostructuren, functionalisering van de nanostructuren van de hoge affiniteit binding van analyten oppervlak optimalisatie voor zowel het minimaliseren van niet-specifieke binding en karakteriseren kinetische snelheidsconstanten met een commercieel Surface Plasmon Resonance (SPR) instrument, integratie van cellijnen op het substraat, en de analyse van beelden en spectrale gegevens. We verwachten van deze techniek om een enabling technology voor de ruimte-tijd in kaart brengen van de cel afscheidingen en hun causale relaties met het ontvangen van cellen.
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |