En etikett-fri teknikk for rom-tid-Imaging av enkeltcelle Sekret

Summary

Inter-mobil kommunikasjon er viktig for å kontrollere forskjellige fysiologiske aktiviteter innenfor og utenfor cellen. Dette notatet beskriver en protokoll for måling av rom-tid natur encellete sekret. For å oppnå dette, er en tverrfaglig tilnærming brukes som integrerer label-free nanoplasmonic sensing med levende celle bildebehandling.

Abstract

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.

In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.

A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Introduction

Inter-mobil kommunikasjon er viktig for regulering av mange fysiologiske aktiviteter både i og utenfor cellen. En rekke proteiner og vesikler kan bli utskilt som senere utløser komplekse cellulære prosesser som differensiering, sårheling, immunrespons, migrering og proliferasjon. ^1-5 Feil på inter-cellulære signalbaner som har vært implisert i en rekke lidelser, inkludert kreft, aterosklerose og diabetes, for å nevne noen.

Den optimale celle sekresjon analysen, skal være i stand til romlig og tidsmessig å kartlegge det utskilte protein av interesse uten å forstyrre de relevante signalveier. På denne måten årsaksforhold mellom konsentrasjonsprofiler og responsen til den mottakende celler kan utledes. Dessverre har mange av de mest brukte lysrør-baserte teknikker ikke oppfyller disse kriteriene. Fluoriserende fusjonsproteiner kan anvendes for å merke analytten wTVen på cellen, men kan forstyrre den sekretoriske vei, eller hvis utskilt, resulterer i en diffus glød utenfor cellen som er vanskelig å kvantifisere. Fluorescerende immunosandwich-baserte analyser er de mest brukte metoder for påvisning av cellulære sekret men vanligvis krever isolasjon av individuelle celler. ^6-11 i tillegg innføring av føle antistoffet typisk stopper eller avsluttes forsøket og størrelsen av antistoff etiketter, 150 kDa for IgG, er et hinder for nedstrøms signalering.

På grunn av disse sperringer er det foretrukket at en etikett-fri teknikk benyttes til bilde protein sekreter og blant eksisterende label fritt teknologier, overflate-plasmonresonans (SPR) og lokalisert overflate-plasmonresonans (LSPR) sensorer er gode kandidater. ^12-17 Disse sensorer har blitt mye brukt for analysebindings studier av proteiner, exosomes og andre biomarkører. ^18-24 Ved LSPR, den plasmonic nanostructures kan mønstret litografisk på dekkglass og begeistret bruker synlig lys via standard bredt felt mikros konfigurasjoner. På grunn av deres nanoskala fotavtrykk, flertallet av glassubstratet er tilgjengelig for vanlige avbildningsteknikker slik som lyse-feltet og fluorescensmikroskopi fremstilling av disse probene godt egnet for integrasjon med levende celle-mikroskopi. ^{25 til 28} Vi har vist at sanntidsmåling av antistoff sekreter fra hybridomceller bruker funksjongull Plasmonic nanostrukturer med romlige og tidsoppløsning på 225 msek og 10 mikrometer, henholdsvis. Den grunnleggende chip konfigurasjonen er vist i figur 1. ²⁸ Utgangs lysbanen til mikroskopet er delt mellom et CCD-kamera som brukes for bilder og en fiber-optisk koplet spektrometer for kvantitativ bestemmelse av okkuperingsandelen av en gitt rekke av nanostrukturer (figur 2 ).

Den protocol presentert i denne artikkelen beskriver eksperimentelt design for sanntids måling av enkeltcelle sekreter samtidig med overvåking av responsen av cellene ved hjelp av standard lys-felt mikroskopi. Det tverr tilnærming omfatter fabrikasjon av nanostrukturer, funksjonalisering av nanostrukturer for høyaffinitets binding av analytter, overflate optimalisering for både å minimalisere ikke-spesifikk binding og karakterkinetiske hastighetskonstantene ved hjelp av et kommersielt overflate-plasmonresonans (SPR) instrument, integrering av cellelinjer på underlaget, og analysen av bilder og spektrale data. Vi forventer denne teknikken til å være en slik teknologi for rom-tid-kartlegging av celle sekreter og deres årsakssammenhenger med mottar celler.

Protocol

1. Nanostrukturen Fabrication Velge 25 mm diameter dekkglass med en omtrentlig tykkelse på 170 pm (nr 1,5) som substrater for nanofabrication. Fordype glassene i piraja løsning (3: 1 ratio av svovelsyre og hydrogenperoksid) i minst 6 timer. Vask piranha dynket dekkglass med store mengder ultra 18,2 Megohm avionisert destillert vann (DDW). FORSIKTIG: Piranha syre reagerer voldsomt med organiske materialer og må behandles med ekstrem forsiktighet. Depositum 10 nm krom tynn film på glassene ved fordampning e-stråle for å unngå lade effekter under mønstringen og avbildning av nanostrukturer. Spinne det første laget av bilaget motstå bestående av etyllaktat metylmetakrylat (MMA_EL6) copolymer ved 2000 rpm i 45 sek og deretter stek ved 150 ° C. Spinn det andre laget av poly-metylmetakrylat (950PMMA_A2) ved 3000 rpm i 45 sekunder og stek ved 180 ° C. Pattern bilaget motstå hjelp av elektronstråle litografi (EBL) ved 25 kV med et areal dose på 300 mikrochipen / cm 2. Utvikles i isopropylalkohol (IPA) / metylisobutylketon (MIBK): 2/1 og skyll i IPA. Innskudd Ti (5 nm) / Au (80 nm) film på underlaget ved hjelp av et e-beam fordamper. Etter gullet deponering, løft av copolymer bilaget motstå av soaking underlaget i aceton i 4 timer. Inspisere underlaget ved hjelp av scanning elektronmikroskop (SEM) for å bekrefte nanostrukturen form og størrelse, fjerne gjenværende krom fra substratet via våt etsing ved hjelp av CR-7 etsemiddel i 60 sek ved RT, og deretter skylles i DDW. Designe en senter-til-senter avstanden mellom matrise av 33 um for å gi rom for celle avbildning mellom rekker. Mønster nanostrukturer i 20 x 20 mønster for hver matrise med en stigning på 300 nm ved hjelp av en e-bjelke forfatter. Hver brikke inneholder 300 matriser med en typisk nanostrukturen dimensjon på 80 ± 2,5 nm høyde og 70 ± 2,5 nm Diameter. Inspisere en undergruppe av matriser ved hjelp av atommikroskop (AFM) for verifisering av størrelse og ensartethet. Feste en støttering, typisk silisium, til baksiden av dekkglass ved bruk av en UV-herdende epoksy. 2. Chip Rengjøring og Application of Self-montert med ett lag For rengjøring og regenerering chips, plasma aske ved en effekt på 40 W i en 300 mTorr blanding av 5% hydrogen, 95% argon i 45 sekunder etter rengjøring av kammeret i 5 minutter under de samme betingelser. Funksjonalisere gullnanostrukturer umiddelbart etter plasma foraskning ved neddykking av brikken i en to-komponent-tiol etanolisk løsning som består av et 3: 1 forhold av SH- (CH2) 8 -EG 3-OH (SPO) og en komponent med enten et amin eller karboksyl-funksjonelle gruppe, nemlig, SH- (CH 2) 11 -EG 3 NH2 (SPN) eller SH- (CH 2) 11 -EG 3 COOH (SPC). La chip jegn tiol løsningen O / N for å danne en selv-sammenstilt monolaget (SAM). Skyll chip med etanol og tørkes med nitrogengass. Hvis nødvendig, lagre den funksjon chip for inntil 2 uker ved 4 ° C. Når den er klar for bruk reagere SPN eller SPC komponent med liganden ved hjelp av en kjemi, avhengig av valget av ligand (se nedenfor). Merk: Brikkene kan regenereres og re-funksjon titalls ganger. En gitt brikken kan benyttes i perioder som varierer fra 6 måneder til over et år. Den spektra målt på et gitt gruppe er pålitelig reprodusert etter gjentatte regenereringer av plasma foraskning, etterfulgt av biofunctionalization. 29 3. Surface funksjon og Kinetic Karakterisering Merk: Bruk funksjon chip i den kommersielle SPR instrument for å karakterisere de kinetiske hastighetskonstanter mellom liganden og analytten, samt til å studere motstanden av SAM til ikke-spesifikt binding. Det er et bredt spekter av strømningsrater og microfluidic design som gir mulighet for effektiv overflaten funksjon. Siden vi har en kommersielt tilgjengelig SPR vi standardisert rundt sin anbefalte strømningsrater. Vi merker oss at disse hastigheter er typisk for alle SPR instrumenter og så er ikke restriktive. SPR instrument er ikke en nødvendighet, siden alle funksjon kan gjøres direkte på LSPR chip, men det gjorde redusere vår arbeidsbelastning fordi det er en multiplekset instrument mens vår LSPR microfluidic oppsett er det ikke. Functionalize en kommersiell nakne gull chip med SAM som beskrevet i punkt 2. Ved å bruke en SPC basert SAM, aktiverer karboksylgruppen med en 1: 1 blanding av 133 mM av 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) og 33 mM N-hydroksysuccinimid (NHS) i DDW for 10 min. Konjugere den aktiverte karboksylgruppen med antistoffet / liganden av interesse for 300 sekunder ved bruk av en strømningshastighet på 30 mL / min. Klargjør ligander ipH 6 fosfatbuffer, typisk, men dette kan variere avhengig av molekylet. Etter konjugering ligand, flyter 0,1 M etanolamin i fosfat-bufret saltvann (PBS) som en deaktivator trinn for 300 sekunder ved en hastighet på 30 mL / min. Etanolamin bidrar til å minimere ikke-spesifikk binding. Introduser analytten av interesse ved en strømningshastighet på 100 ul / min ved anvendelse av et område av konsentrasjoner og beregne de kinetiske hastighetskonstantene ved hjelp av en kinetisk analyse-programvare. Hvis ikke-spesifikk binding er problematisk, øker forholdet mellom SPO til SPC eller SPN. 4. LSPR Generelle innstillinger Mikroskop innstillinger: Bruk en 100 W Halogenlampe til Koehler belyse prøven. Bruk en lang pass filter (typisk 593 nm cutoff) i lysbanen for å eliminere bølgelengder som ikke bidrar til resonans shift (figur 2). For LSPRi datainnsamling, bruk en invertert mikroskop med en 40X olje immersion objektiv (1,4 NA) og en thermoelectrically avkjølt 16 bit CCD kamera. Plasser en stråledeler ved utgang av mikroskopet å skaffe Imagery og spektra samtidig. Sett temperaturkontrollert mikroskopet scenen til 37 ° C og likevekt i 4 timer. Innlemme et ytterligere inkubering montering på mikroskopet for å regulere konsentrasjonen av CO 2 og fuktighet på 5% og 95%, respektivt. Chip forberedelse og montering: Funksjonalisere den LSPR chip som beskrevet i punkt 2 med den optimale to-komponent SAM forhold bestemt fra SPR-eksperimenter. Laste chip i en spesiallaget microfluidic holderen som følger. Plassere chip på en aluminiumsbunnstykket. Sandwich chip mellom denne bunnen stykke og en silikonpakning og en klar plast toppstykket. Bruk 4 skruer å klemme forsamlingen. For en typisk SPC-baserte applikasjon tiol, slippe belegge 300 ul av en 1: 1 blandingratur på 133 mM EDC og 33 mM NHS i DDW for å aktivere karboksyl-gruppene i SPC tiol-komponent. Vent i 10 minutter og manuelt skylle overflaten med 10 mM PBS. Konjugere den aktiverte karboksylgruppen med liganden (typisk et antistoff eller antistoff-fragment) av interesse for dråpe belegging 300 ul av ligand-løsning. Vent i 30 minutter og manuelt skyll med 10 mM PBS. Drop frakk 300 ul 0,1 M etanolamin i PBS på brikken for å redusere ikke-spesifikk binding. Vent i 10 min. Vask etanolamin med PBS inneholdende 0,005% Tween 20 (PBS-T20). Plasser en kvarts stykke ovenfor brikken for å redusere svingninger i data relatert til en endring menisk. Hold chip våt med PBS-T20 buffer mens montering på mikroskop. Plasser LSPR chip montering godt inn i oppvarmet scenen prøveholderen og fest microfluidic tubing. Fest MicroFluidics slangen til montering og strømnings buffer (eller serum frie medier for cellestudier) inntil en stabil tilstand er nådd. Tillater montering og mikroskop for å ekvilibrere i minst 2 timer. Juster brikken ved hjelp av styrespaken, slik at den sentrale matrise er på linje med den fiberoptiske for spektroskopi. Spektroskopiske data er tatt ved hjelp av et spektrometer og spektralanalyse programvare. Hold arrays i fokus gjennom hele eksperimentet ved hjelp av programvare autofokus, Zeiss Definite Focus eller tilsvarende autofokus enhet. 5. LSPR Imaging of Anti-c-myc Sekret fra 9E10 hybridomceller Merk: hybridom-cellelinje som brukes i denne studien uttrykker anti-c-myc-antistoff konstitutivt og dermed ikke krever en kjemisk trigger Functionalize nanostrukturer med c-myc peptid. Dette har en K-D-verdi på 1,77 nM for de anti-c-myc-antistoffer utskilles av klon 9E10 hybridomceller. Kultur hybridomcellene i complete vekstmedium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika i en T75-kolbe ved 37 ° C under 5% CO2. Opprettholde en celletetthet på 4 x 10 5 celler / ml. For de celle sekresjon studiene pellet celler fra T75-kolbe ved sentrifugering, vaskes to ganger med RPMI-1640 serumfritt medium (SFM) for å fjerne de utskilte antistoffer og justere celletettheten til 4 x 10 6 celler / ml. Høste celler og test for levedyktighet før du introduserer dem videre til LSPR chips. Introduser 50 mL av celleløsning manuelt på de LSPR chips med en mikropipette. Etter noen få minutter 25 til 50 celler som fester seg til overflaten av de LSPR chips. Vaske bort de gjenværende celler i oppløsning med frisk SFM hjelp av perfusjon mikrofluidsystem. Velg LSPR arrays for bildebehandling som er nær, innen 10 mikrometer, men ikke overlapper med cellene. For å sikre at signalet som er spesifikke for den utskilte anti-c-myc Antibodies innføre celledyrkingsmedier med og uten tilstedeværende antistoffer, så vel som med antistoffene, men med sine bindingsseter blokkert ved nærvær av et mettende konsentrasjon av c-myc-peptid i løsningen. Kalibrere sensorene ved slutten av hvert løp med en mettende løsning av anti-c-myc-antistoffer (250 nM). Dette bidrar til å normalisere responsen av følerne og bestemme okkuperingsandelen basert på biofunctionalization profilen til hver kjøring. Korriger drift i X og Y retning ved hjelp av bildejustering programvare.

Representative Results

I en typisk levende celle sekresjon studie er det flere moduser for innsamling av data finner sted. Figur 3 viser en overlapping av et LSPRi bilde, som fremhever de kvadratoppstillinger, og en transmittert lys belyst bilde som fremhever den cellen ved nedre venstre. Data blir typisk samlet inn over en 3-timers periode, fulgt av innføring av en metnings oppløsning av analytten for normalisering beregningen beskrevet nedenfor. Fluorescens bilder kan også være integrert i datainnsamlingsrutinen ved automatiske svitsjing av et filter kube. På figur 4 er en celle farget med det fluorescerende fargestoffet rhodamin membranen DHPE oppviser lamellipodia lignende utvidelser (piler). Dersom slike utvidelser skulle overlappe med matriser vil de gi et falskt positivt for proteinutskillelse. Å ha flere moduser av bildene kan bidra til å identifisere slike hendelser. Figur 5 viser spektrometri data før og akteruter innføring av en metnings oppløsning (400 nM) kommersielt innkjøpt anti-c-myc antistoff til c-myc funksjonaliserte matriser. Ingen celler var tilstede i dette eksperimentet. Spekteret viser både en rød skift og en økning i intensitet. Forskjellen mellom arealene under de to kurvene resulterer i en økning i matrisen bildeintensiteten i LSPRi modus på CCD-kamera. En ikke-lineær minste kvadraters analyse av data tilnærming har blitt utviklet for å utlede okkuperingsandelen av overflate bundet ligander fra spektrene. 30,31 Ved slutten av eksperimentet, er mettet intensitetsverdier (dvs. okkuperingsandelen ≈ 1) blir brukt til å beregne en normalisert respons for hver oppstilling ved hjelp av følgende formel: Der er den normaliserte intensiteten ved tidspunktet t, den opprinnelige intensitet ved starten av eksperimentet, slutt mettet intensitet, og målte intensitet av oppstillingen ved tidspunkt t </em>, respektivt. Normaliserte verdier fra to matriser er vist i figur 6. En matrise ble i løpet av 10 um av cellen som undersøkes, mens den andre, anvendt som en kontroll, var en avstand på 130 mikrometer fra cellen. Den plutselige økning i den normaliserte responsen av oppstillingen nærmest cellen i forhold til den flate responsen i kontrollsammenstillingen er indikativ for en lokalisert eksplosjon av utskilte antistoffer. Figur 1. Sensor Design. En tegning som viser geometrien til et typisk levende celle sekresjon eksperiment. Cellen (blå sfæroid) avsettes på den LSPR chip som inneholder oppstillinger av biofunctionalized gull nanostrukturer. I zoomet inn syn, celle sekresjon av interesse, i dette tilfellet antistoffer er vist som Y-formede molekyler, måles som de binder seg til overflatenav de funksjonnanostrukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Optisk Setup. Det opplyste lys fra en halogenlampe er først filtrert av en lang pass filter (LP). Lyset er lineært polarisert (P1) og lyser prøven via en 40X / 1.4 NA objektiv. Det spredte lys samles opp av objektivet og føres gjennom en krysspolarisatoren (P2). En 50/50 strålesplitter (BS) er satt inn i den oppsamlede lysbanen for samtidig spektroskopisk og bildeanalyse. Øverst til høyre:. En atomic force mikroskopi bilde av 9 individuelle nanostrukturer atskilt med en stigning på 300 nm Vennligst klikk herfor å se en større versjon av dette tallet. Figur 3. Live-Cell LSPRi Study. Et sammenslått overført lys og LSPRi bilde som viser et enkelt hybridomcelle (nederst til venstre) omgitt av 12 arrays. Dette er en kontrast forbedret bilde. Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4. Levende celle fluorescens Study. En fluoriserende falske fargebilde av en enkelt celle hybridom beiset med rhodamin DHPE, som er en membran fargestoff. I fluoriserende bildemodus arrays er vanligvis ikke synlig, men er en nærliggende rekke observer her som abmangler firkant i nedre høyre hjørne. Cellen kan ses å være atskilt fra matrisen selv tentacle lignende utvidelser (muligens filopodia eller lamellipodia) som strekker seg utover fra de celler (piler). Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5. Spectral modalitet. Oppnådd fra et c-myc funksjonalisert matrise før og etter innføringen av 400 nM oppløsning av anti-c-myc antistoff spektra. Ingen celler var tilstede i denne studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <img alt="Figur 6" src= "/ filer / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg" /> Figur 6. enkelt celle sekresjon. Responsen i en matrise som ligger innenfor 15 mikrometer av en enkelt celle og en ligger 130 mikrometer unna (Control). Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.^7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.

There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.

The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.³³ Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.

Materials

25mm diameter glass coverslips	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate	Microchem	PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate	Microchem	MMA EL6
Electron beam evaporator	Temescal	FC-2000
Electron beam lithography	Raith	Series 150
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Acetone	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 chromium etchant	Cyantek	CR-7
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 55
Atomic force microscope	Veeco	Nanoscope III
Plasma ashing system	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system	Biorad	XPR36
Bare gold chip	Biorad	GLC chip	Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo	24510
Pentylamine-Biotin	Thermo	21345
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraavidin	Thermo	31000
Phosphate buffered saline	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Inverted microscope	Zeiss	Axio Observer	Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera	Hamamatsu	Orca R2	Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc peptide HyNic Tag	Solulink	SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody	Sigma-Aldrich	M4439
Hybridoma cell line	ATCC	CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Serum free media RPMI 1640	Invitrogen	11835-030
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Rhodamine DHPE	Life Technologies	L-1392