Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Culture fetta organotipiche del sistema nervoso centrale (SNC) sono stati ampiamente utilizzati per studiare diversi fenomeni fisiologici e patologici che raggiungono dallo sviluppo neuronale alla neurodegenerazione. Rispetto a colture di cellule dissociate, fette organotipiche offrono il vantaggio di una maggiore complessità con citoarchitettura intatta e circuiteria sinaptica locale. Allo stesso tempo, il tessuto può essere analizzato in modo isolato, senza la necessità di coinvolgere la complessità del tutto in contesto vivo. Inoltre, l'accesso facile e ripetuto alle cellule di scelta è giustificata, l'ambiente extracellulare può essere controllata con precisione e di solito, modelli in vitro sono meno costosi rispetto alle loro controparti in vivo. Negli ultimi anni, diversi studi presentati somiglianze tra i profili di sviluppo delle culture a lungo termine contro gli animali corrispondenti che vivono 1,2. E 'stato dimostrato che i circuiti neuronali di varia CNS regions esprimono l'attività di rete spontanea durante lo sviluppo e che le fette organotipiche parzialmente mantenere questo fenomeno 3 -7. Isolato preparazioni midollo spinale sono stati particolarmente utilizzato per indagare generazione ritmo 6 e la formazione di circuiti neuronali 1.
Un modo per registrare l'attività spontanea di fette organotipiche è loro coltura in cima array multi-elettrodo (MEA). Questi dispositivi contengono elettrodi multipli in grado di monitorare i potenziali extracellulari generati dai potenziali d'azione da numerose celle contemporaneamente (registrazione multi-unità). La risoluzione temporale elevata delle registrazioni MEA può essere utilizzato per ricostruire la dinamica precisa attività di un dato circuito neuronale. Inoltre, a differenza di patch-bloccaggio la tecnica è non invasiva, che consente misurazioni a lungo termine e comporta il fatto che i neuroni non sono interessati nel loro comportamento.
Fo lo scopo di questo studio, la combinazione di midollo spinale co-colture organotipiche e registrazioni multisito stato usato per studiare la rigenerazione funzionale all'interno del midollo spinale. Dal adulti vertebrati superiori sono potenzialmente in grado di recuperare dai danni del midollo spinale limitato, diverse strategie sono state studiate per promuovere la rigenerazione dopo una lesione del midollo spinale. Finora, il tratto corticospinale è stato in genere il sistema di modello di scelta per tali indagini. Questi esperimenti sono in genere in termini di tempo, costosi e richiedono grandi coorti di animali a causa dell'elevata variabilità all'interno di singoli gruppi. Inoltre, l'evidenza suggerisce che le connessioni propriospinali (neuroni che sono interamente trovino all'interno del midollo spinale) possono svolgere un ruolo centrale nel processo di recupero a seguito di lesioni del midollo spinale 8. Queste fibre sono difficili da studiare in vivo, senza l'interferenza di ascendente e discendente tratti di fibre. Bonnici e Kapfhammer 9 utilizzati longitudinale midollo spinaleculture fetta di topi postnatali, come un approccio alternativo. Dopo l'esecuzione di lesioni meccaniche hanno analizzato semi-quantitativamente la rigenerazione degli assoni morfologica tra segmenti del midollo spinale. Essi hanno osservato meno, ma non nessuno assoni che attraversano il sito della lesione nelle culture tagliato in età matura. Al contrario, le culture che sono stati lesionati in una fase più giovane visualizzate una quantità elevata di rigenerazione assonale 5 – 7 giorni dopo il danno. Tuttavia, la prova per connessioni funzionali non è stato presentato.
Pertanto, lo sviluppo di un rappresentante modello in vitro di fibre propriospinali che permette la ricerca di rigenerazione funzionale può essere un valido strumento per estendere la nostra conoscenza dei processi rigenerativi del midollo spinale.
Diversi elementi della procedura presentata sono fondamentali per la realizzazione di esperimenti accurati e riproducibili. Tutte le fasi durante la preparazione dei MEA, soluzioni e la produzione delle culture fetta sono eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Gli antibiotici non sono applicati al terreno nutritivo perché possono influenzare l'attività spontanea 14. Durante il rivestimento MEA, la parte più importante è assicurarsi che la soluzione di gel matrice extracellulare rimane freddo in ogni momento. Scongelare in frigorifero e tenerlo in ghiaccio per tutta la procedura al fine di garantire una temperatura massima prossima a 0 ° C. Durante la preparazione del isolamento rapido fette e sezionamento, nonché facendo attenzione a bassa temperatura utilizzando ghiaccio buffer dissezione a freddo aumenta la percentuale di colture sane. Inoltre, il plasma / trombina coagulazione è una delle fasi più critiche. Per prima cosa, assicurarsi che il plasma è propriamente mixed con la trombina. In secondo luogo, prestare particolare attenzione a rimuovere il più residui possibile per garantire il corretto fissaggio delle fette ai MEA. Questo passo è estremamente sensibili al fattore tempo; se l'intervallo di tempo è troppo breve, troppo della miscela plasma / trombina viene rimosso. Se l'intervallo di tempo è troppo lungo, coagulazione già avvenuto, aumentando il rischio di rimuovere le fette insieme al residuo plasma / trombina.
Se sono previsti lesioni meccaniche, è importante utilizzare MEA con una accurata progettazione. La zona in cui è destinata la lesione deve essere privo di elettrodi, fili e isolamento. In caso contrario, l'impianto elettrico del MEA stanno per essere danneggiate e di conseguenza, non possono essere eseguite le registrazioni più.
Un altro passo cruciale riguarda la dimensione della lesione. E 'stato dimostrato in precedenza che ricollegare due giovani fette dopo lesione richiede circa due giorni 10. Per tutti gli esperimenti, la regola generale è stato utilizzato che lo spazio between le fette dopo lesione non dovrebbe essere più grande della larghezza del MEA scanalatura (300 micron). Una dimensione della lesione più grande potrebbe provocare un arco di tempo più lungo per la riconnessione o, se la lesione è troppo grande, nessuna riconnessione a tutti. Per annotare, ex esperimenti hanno rivelato che una collocazione iniziale delle due fette più lontano di 1 mm risultati in un tasso di connessione è molto modesto.
Prima dell'inizio delle registrazioni, un tempo regolazione di almeno 10 minuti a RT, invece di 37 ° C dell'incubatrice, e alla soluzione extracellulare, invece del mezzo nutrizione è raccomandato. Un'attenta osservazione del pattern attività durante questi primi minuti assicura che i dati misurati rappresentano il pattern scoppio della coltura appropriato dopo la registrazione è stata avviata.
Per la rilevazione dell'attività, acquisizione dati e l'ulteriore elaborazione, hardware casalingo (registrazione camera, collegamenti agli amplificatori e amplificatori), programmi nel laboratorioVISTA, sono utilizzati C ++ e IgorPro. Configurazioni MEA commerciali e altri pacchetti software sono adatti anche per tali operazioni. Qui, i segnali vista dagli elettrodi vengono amplificate 1001 volte, e poi digitalizzato ad una velocità di 6 kHz.
Il modello presentato può essere uno strumento utile per esaminare le connessioni propriospinali perché in vivo, sono difficili da studiare senza l'interferenza di ascendente e discendente tratti di fibre. Il co-coltura di due fette del midollo spinale può elegantemente aggirare questo problema. Le colture forniscono un microambiente che può essere strettamente controllata e facilmente manipolabili. D'altra parte, ingresso sovraspinale e sensoriale è mancante naturalmente. Inoltre, il processo di preparazione della cultura rappresenta una situazione di danno al SNC. Le cellule gliali come astrociti e microglia sono noti per rispondere alle lesioni con aumento della proliferazione e di conseguenza, il tessuto è in una certa misura riorganizzata. Relativamente alla modalità presentatol la formazione di una cicatrice gliale dopo aver eseguito lesioni meccaniche non è stata osservata. Una spiegazione potrebbe essere che meccanismi adattativi di astrociti sono stati già attivati durante il processo di preparazione e che le lesioni delle culture non producono ulteriori risposta. Inoltre, non ci sono prove del coinvolgimento di inibitori associati mielina, ad es., Nogo-A, nel potenziale rigenerazione basso di culture lesionati in età avanzata. Tuttavia, è stato dimostrato che il trattamento con l'inibitore della fosfodiesterasi 4 Rolipram, partendo direttamente dopo aver eseguito lesioni a 23 DIV aumenta la rigenerazione funzionale tra le fette 10. Questi risultati dimostrano che il recupero funzionale può essere aumentata in vecchie culture. Notevolmente, quando il conteggio del numero di assoni che attraversano il sito della lesione, nessuna differenza tra le culture lesionati in giovane età e culture lesionati in età avanzata è stato scoperto. Questi risultati suggeriscono che la mancanza di rigenerazione assonale non è la ragione principale fo la perdita di recupero dopo lesioni tardivi in cultura e quindi sottolineano l'esigenza di un modello che permette l'analisi funzionale della rigenerazione. Formazione sinaptica e la plasticità sinaptica potrebbero svolgere un ruolo importante nel processo di recupero 10. Questi meccanismi hanno guadagnato molta attenzione negli ultimi anni ed è ormai ampiamente accettato che essi hanno un impatto importante sul risultato dopo una lesione del midollo spinale. Pertanto, un modello che offre le condizioni stabili per indagare questi processi in isolamento e in grande dettaglio può certamente aiutare ad ottenere comprensione circa la rigenerazione funzionale nel midollo spinale.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |