miRNA Expression Analyser i Prostate Cancer kliniska vävnader
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
En kritisk utmaning i prostatacancer (PCA) klinisk behandling ställs av otillräckliga för närvarande används biomarkörer för sjukdomsscreening, diagnos, prognos och behandling. Under senare år har mikroRNA (miRNA) framträtt som lovande alternativa biomarkörer för prostatacancer diagnos och prognos. Men utvecklingen av miRNA som effektiva biomarkörer för prostatacancer är starkt beroende av deras noggrann detektering i kliniska vävnader. miRNA analyser i prostatacancer kliniska prover ofta utmanande på grund av tumör heterogenitet, urvalsfel, förorening stromal etc. Målet med denna artikel är att beskriva en förenklad arbetsflöde för miRNA analyser i arkiverad FFPE eller fryst prostatacancer kliniska prover med hjälp av en kombination av kvantitativ realtids-PCR (RT-PCR) och in situ-hybridisering (ISH). Inom detta arbetsflöde, vi optimera de befintliga metoderna för miRNA extraktion från FFPE och frysta prostata tissues och uttryck analyser av Taqman-prob baserad miRNA RT-PCR. Dessutom beskriver vi en optimerad metod för ISH analyserar formiRNA detektion i prostatavävnad med hjälp av låst nukleinsyra (LNA) – baserade prober. Vår optimerade miRNA ISH protokollet kan tillämpas på prostatacancer vävnad diabilder eller prostatacancer vävnad microarrays (TMA).
Introduction
Cancer i prostatakörteln är en mycket gemensamt diagnostiserade manliga malignitet som är en av de främsta orsakerna till cancerrelaterad dödlighet bland män. I USA, uppskattningsvis 220,800 nya fall och 27,540 dödsfall kommer att redovisas under 2015 1.
Prostatacancer är en heterogen sjukdom med mycket varierande sjukdom kurs- tumörer kan vara loj eller mycket aggressiv. En kritisk utmaning i prostatacancer klinisk behandling ställs av otillräckliga för närvarande används metoder / biomarkörer för sjukdomsscreening, diagnos, prognos och behandling 2. Nuvarande screeningmetoder innefattar prostataspecifikt antigen (PSA) testning och en digital rectal undersökning (DRE) följt av prostatabiopsier 3. Prostataspecifikt antigen (PSA) är den mest använda prostatacancer biomarkör som väsentligt har revolution klinisk behandling och förbättrade överlevnad 4. Men på grund av inneboende begränsningar av PSA inklusive lack från specificitet, PSA baserad screening har lett till över diagnos och över behandling av sjukdomen. Mot bakgrund av detta, är ett intensivt arbete är riktad mot ett sökande efter alternativa prostatacancer biomarkörer, särskilt sådana som kan förutsäga aggressiviteten av sjukdomen och kör bättre behandlingsbeslut 4,5. Under de senaste åren har mikroRNA (miRNA) dykt upp som lovande alternativa prostatacancer biomarkörer.
MicroRNAs (miRNA) utgör ett evolutionärt konserverad klass av små icke-kodande RNA som hämmar genuttryck efter transkription via sekvensspecifika interaktioner med 3'- otranslaterade regioner (UTR) av besläktade mRNA-mål. Det uppskattas att> 60% av mRNA bevaras mål för miRNA 6. miRNA gener är belägna i intergeniska regioner eller inom introner eller exoner av protein / icke-proteinkodande generna 7. Dessa gener är företrädesvis transkriberas av RNA-polymeras II i primary miRNA (pri-miRNA flera kilobaser lång) som bildar hårnålsformiga spindeln loop sekundära strukturer. Dessa pri-miRNA bearbetas till föregångare miRNAs (pre-miRNA, 60-75 nukleotider lång) som exporteras till cytoplasman och bearbetas vidare till mogna miRNA (18-25 nukleotider lång) 8-10. miRNAs reglerar viktiga cellulära processer, inklusive spridning, utveckling, differentiering och apoptos 11. Studier tyder på en utbredd dysreglering av miRNA uttryck profiler i olika humana maligniteter inklusive prostatacancer 12-15. miRNA uttryck profiler har rapporterats vara allmänt oreglerad inom primärvården och metastaserande prostatacancer. Förändrad miRNA uttryck har kopplats med prostatacancer progression, aggressivitet och återfall belysa prognostiska potential miRNA 12,14,16-19. En växande mängd bevis tyder på att miRNAs spela viktiga mekanistiska roller i prostatacancer inledande utveckling, framstegjon och metastas. Sammantaget miRNA växer fram som lovande alternativa biomarkörer för prostatacancer diagnos och prognos som kan skilja mellan normala och cancervävnader och stöd skiktning av prostatatumörer 12. Även miRNAs är viktiga mål för utveckling av effektiva läkemedel mot prostatacancer 20.
På grund av sin ringa storlek och motståndskraft mot endogen RNas aktivitet miRNAs är stabila biomarkörer som lätt kan detekteras i formalinfixerade vävnader 21 och prostatabiopsier 22. Dessutom har uttryck profiler av miRNA jämförts i frysta och formalinfixerade vävnader och har visat sig vara starkt korrelerade 21. Dock är miRNA uttryck profilering i prostatacancer kliniska vävnader ofta utmanande på grund av tumör heterogenitet, urvalsfel, förorening stromal etc. Utvecklingen av miRNA som effektiva biomarkörer för prostatacancer kraftigt relies på deras noggrann detektering i kliniska vävnader. Här beskriver vi en förenklad arbetsflöde som används i vårt labb för miRNA uttryck profilering i arkiverad FFPE eller fryst prostatacancer kliniska prover. Vi använder en kombination av kvantitativ realtids-PCR och in situ hybridisering för miRNA analyser av kliniska prover, med den förstnämnda ger mer kvantitativ information och den senare för att visualisera det differentiella uttrycket av potentiella miRNA biomarkörer i en rad vävnader. Inom detta arbetsflöde, vi optimera de befintliga metoderna för miRNA extraktion från FFPE och frysta prostatavävnad, analyserar uttryck av Taqman-prob baserad miRNA RT-PCR och miRNA in situ hybridisering teknik med hjälp av låst nukleinsyra (LNA) -baserade sonder 23. LNA-baserade prober erbjuder ökad känslighet och specificitet jämfört med DNA- eller RNA- baserade prober och möjliggör robust detektering av alla miRNA sekvenser, oavsett GC-innehåll och även tillåta disning av miRNA familjer. Vår optimerade miRNA ISH protokollet kan tillämpas på prostatacancer vävnad diabilder eller prostatacancer vävnad microarrays (TMA), med den senare erbjuder möjlighet att accelerera miRNA biomarkörer.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln beskriver vi ett förenklat arbetsflöde för miRNA uttryck profilering i arkiverade FFPE eller fryst prostatacancer kliniska vävnader. I prostatacancer, flera studier tyder på en viktig roll mikroRNA i prostatacancer initiering, progression och metastasering. Men motstridiga resultat ofta erhålls på en specifik miRNA 22 eftersom miRNA utvinning och analyserar metoder varierar kraftigt. Mot bakgrund av den framväxande bevis för den möjliga tillämpningen av miRNA som alternativa pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Roger Erickson för hans stöd och hjälp med utarbetandet av manuskriptet.
Detta arbete stöddes av National Cancer Institute vid National Institutes of Health
(Grant Number RO1CA177984, RO1CA138642), VA programprojekt på prostatacancer (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
