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Imunologia e Infecção

इमेजिंग रोगजनन और के मुताबिक गूढ़ रहस्य और<em> माइकोबैक्टीरियम abscessus</em> Zebrafish भ्रूण में

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

माइकोबैक्टीरियम abscessus मानव में नैदानिक ​​सिंड्रोम की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है कि एक उभरते हुए रोगज़नक़ है। ये त्वचा संबंधी संक्रमण के रूप में अच्छी तरह से गंभीर क्रोनिक फेफड़े में संक्रमण, ज्यादातर प्रतिरक्षा में और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों 1,2,3,4 में सामना करना शामिल हैं। एम abscessus भी मनुष्यों में nosocomial और चिकित्सकजनित संक्रमण के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख तेजी से बढ़ते माइक्रोबैक्टीरियल प्रजाति के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, हाल ही में कई रिपोर्टों संभावना पर प्रकाश डाला कि एम abscessus रक्त मस्तिष्क बाधा पार और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 5,6 में महत्वपूर्ण घावों को प्रेरित कर सकता है। एक तेजी से उत्पादक, एम होने के बावजूद यह भी abscessus दर्शाती granulomatous संरचनाओं के भीतर साल के लिए चुप रहने के लिए और फेफड़ों 7 में किलाटी घावों को उत्पन्न करने की क्षमता सहित माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के उन लोगों से संबंधित हैं जो कई रोगजनक सुविधाओं,। अधिक खतरनाक कम सेन हैएम के sitivity एंटीबायोटिक दवाओं के लिए abscessus, एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय असफलता की दर 8,9 करने के लिए अग्रणी के इलाज के लिए बेहद मुश्किल इन संक्रमणों प्रतिपादन। इस प्रजाति के महत्वपूर्ण खतरा मुख्य रूप से प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य संस्थानों के 10 में चिंता का विषय है और फेफड़ों प्रत्यारोपण 11 के लिए एक contraindication की है जो एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अपने आंतरिक प्रतिरोध है।

एम abscessus प्रदर्शित करता है अलग अलग नैदानिक ​​परिणामों के लिए नेतृत्व कि चिकनी (एस) या किसी न किसी (आर) कॉलोनी morphotypes। एस तनाव के विपरीत, आर बैक्टीरिया एक रस्सी या रस्सी की तरह संरचना 12,13 के लिए अग्रणी अंत करने के लिए अंत बढ़ने की प्रवृत्ति है। सेलुलर या जानवर या तो मॉडल के आधार पर कई स्वतंत्र अध्ययन आर के हाइपर-डाह फेनोटाइप 14,15 मोर्फोटाइप का पता चला। महामारी विज्ञान के अध्ययन, एम के सबसे गंभीर मामलों से abscessus फेफड़े में संक्रमण आर के साथ जुड़े होने के लिए प्रकट केवल संस्करण हैं, जो 16 वेरिएंट किएक संक्रमित मेजबान 3 में साल के लिए जारी रहती है देखा गया है। मोर्फोटाइप अंतर सतह से जुड़े glycopeptidolipids (जीपीएल) 12 (एस) में उपस्थिति या (आर) में नुकसान पर निर्भर करता है। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध सेलुलर / पशु मॉडल के निहित सीमाओं की वजह से एम अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया abscessus संक्रमण, आर या एस वेरिएंट की pathophysiological घटनाओं के बारे में हमारे ज्ञान अस्पष्ट बनी हुई है। नसों में या एयरोसोल मार्गों के माध्यम से इम्युनो सक्षम चूहों के संक्रमण लगातार संक्रमण और इन विवो दवा संवेदनशीलता परीक्षण 17 के लिए अध्ययन करने के लिए चूहों का उपयोग बाधा, क्षणिक उपनिवेशन की ओर जाता है। इसलिए, मेजबान प्रतिक्रिया के हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी पशु मॉडल को विकसित करने के लिए एक बड़ी चुनौती है। इस संदर्भ में, संक्रमण की गैर स्तनधारी मॉडल ऐसे लागत, गति और नैतिक स्वीकार्यता ओ के रूप में कई लाभ प्रदान करता है कि 18 मेलानोगास्टर ड्रोसोफिला सहित हाल ही में विकसित किया गया हैमाउस मॉडल देखें। संक्रमण का zebrafish (Danio rerio) मॉडल भी गैर इनवेसिव इमेजिंग, एम की प्रगति और कालक्रम से, कल्पना करने के लिए पता लगाया गया है एक जीवित जानवर 19 में abscessus संक्रमण। महत्वपूर्ण बात है, अवधारणा के एक सबूत भी एम के खिलाफ इन विवो एंटीबायोटिक आकलन के लिए इसकी उपयुक्तता प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किया गया था 17,20 abscessus।

zebrafish व्यापक रूप से विभिन्न रोगजनकों और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली 21 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए पिछले दो दशकों के दौरान इस्तेमाल किया गया है। इस विकल्प कशेरुकी मॉडल की बढ़ती सफलता से प्रेरित है और कई वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण 19,22,23,24,25,26,27,28,29 को बेहतर ढंग से समझने के लिए इसके उपयोग के लिए मान्य है कि प्रमुख और अद्वितीय अवसर पर निर्भर करता है। अधिकांश अन्य पशु मॉडल के लिए विरोध के रूप में, zebrafish भ्रूण गैर इनवेसिव इमेजिंग प्रतिदीप्ति 30। यह हा अनुमति देता है, ऑप्टिकली पारदर्शी हैंएम अध्ययन करने के लिए एलईडी abscessus बैक्टीरियल रूपात्मक प्लास्टिसिटी का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं कि बाह्य मुताबिक के विवरण के साथ समापन अभूतपूर्व विवरण के साथ zebrafish भ्रूण संक्रमित। मुताबिक प्रतिरक्षा प्रणाली की तोड़फोड़ के एक नए तंत्र और तीव्र एम के रोगजनन को बढ़ावा देने के एक महत्वपूर्ण तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है abscessus संक्रमण 19।

इस रिपोर्ट में एम के pathophysiological लक्षण समझने के लिए zebrafish भ्रूण का उपयोग कर नए उपकरण और विधियों का वर्णन संक्रमण abscessus और बेसिली और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच अंतरंग बातचीत का अध्ययन करने के लिए। सबसे पहले, एसई प्रति बैक्टीरियल inoculum, भ्रूण तैयार करने, और संक्रमण के प्रसंस्करण शामिल है कि एक विस्तृत microinjection प्रोटोकॉल, प्रस्तुत किया है। तरीके विशेष एम का आकलन करने के लिए अनुकूलित इस तरह मेजबान अस्तित्व और बैक्टीरियल बोझ के रूप में विभिन्न मापदंडों को मापने के द्वारा abscessus डाह, प्रस्तुत कर रहे हैं। विशेष ध्यान देने के तरीके के बारे में दी गई हैएक spatiotemporal स्तर पर, भाग्य और प्रगति के संक्रमण की और एम के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग abscessus। इसके अलावा, एम के दौरान योगदान और मैक्रोफेज की भूमिका की जांच करने के लिए संक्रमण abscessus, तरीकों (genetically- या रासायनिक आधारित या तो तरीकों का उपयोग) मैक्रोफेज समाप्त भ्रूण वर्णित हैं उत्पन्न करने के लिए। अंत में, प्रोटोकॉल निश्चित या रहने वाले भ्रूण या तो उपयोग मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल दस्तावेज हैं के साथ विशेष बातचीत कल्पना करने के लिए।

इस रिपोर्ट का उद्देश्य एम में नया प्रकाश डाला करने के लिए आगे के अध्ययन को प्रोत्साहित करने के लिए है abscessus डाह तंत्र और एक गंभीर और अनियंत्रित संक्रमण की प्रक्रिया की स्थापना में मुताबिक की विशेष रूप से भूमिका।

Protocol

Zebrafish प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रासंगिक संस्थागत और सरकारी नियमों का पालन करना चाहिए। वर्तमान अध्ययन के लिए, zebrafish प्रयोगों प्रयोगशाला पशुओं से निपटने के लिए यूरोपीय संघ के दिशा-निर्देशों के अनुसार, वि…

Representative Results

विभिन्न संरचनात्मक साइटों 32 इंजेक्ट किया जा सकता है, दुम नस में इंजेक्शन अक्सर अस्तित्व प्रयोगों, बैक्टीरियल बोझ दृढ़ संकल्प, phagocytosis गतिविधि या रस्सी गठन सहित बाद के विश्लेषण के लिए प्रणालीगत संक्र…

Discussion

zebrafish हाल ही में वास्तविक समय 36 में विस्तृत क्षेत्र और confocal इमेजिंग का उपयोग बैक्टीरिया के संक्रमण की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। एक साथ सूक्ष्म इ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए और क्रमश: tdTomato और वसाबी की अभिव्यक्ति की अनुमति है कि pTEC27 और pTEC15 की उदार उपहार के लिए लाइपो-clodronate और एल रामकृष्णन को उपलब्ध कराने के लिए लालकृष्ण किस्सा लिए आभारी हैं। फ्रांस के राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी की परियोजनाओं (ZebraFlam ANR-10-मिडी-009 और DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) और यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के इस काम रूपों हिस्सा (FP7 से लोगों-2011-ITN) अनुदान समझौते के तहत नहीं। PITN-जीए-2011-289209 मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क FishForPharma के लिए। हम मुख्यमंत्री ड्यूपॉन्ट के वित्त पोषण के लिए एसोसिएशन ग्रेगरी Lemarchal और Vaincre ला Mucoviscidose (RF20130500835) का शुक्रिया अदा करना भी चाहते हैं।

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
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Referências

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
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