JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Dechiffrera och Imaging patogenes och Cording av<em> Mycobacterium abscessus</em> I zebrafiskembryon

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53130
, , , , ,
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535,Université Montpellier, 2Centre d’études d’agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689,Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM,Université Versailles St Quentin

Summary

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model. In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an in vivo model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Introduction

Mycobacterium abscessus är en framväxande patogen som orsakar ett brett spektrum av kliniska syndrom hos människor. Dessa inkluderar hudinfektioner samt svåra kroniska lunginfektioner, oftast påträffas i nedsatt immunförsvar och patienter med cystisk fibros 1,2,3,4. M. abscessus betraktas också som en stor snabbväxande mycobakteriearter ansvarar för nosokomiala och iatrogena infektioner hos människor. Dessutom betonade flera färska rapporter möjligheten att M. abscessus kunde korsa blod-hjärnbarriären och inducera viktiga lesioner i det centrala nervsystemet (CNS) 5,6. Trots att en snabb odlare, M. abscessus utställningar också flera patogena funktioner som är relaterade till de av Mycobacterium tuberculosis, inklusive förmågan att tiga i flera år inom granulomatösa strukturer och generera Kaseös lesioner i lungorna 7. Mer oroväckande är den låga sensitivity för M. abscessus mot antibiotika, vilket gör dessa infektioner extremt svåra att behandla som leder till en väsentlig terapeutisk felfrekvens 8,9. Det viktiga hot av denna art är främst dess inneboende resistens mot antibiotika, vilket är av stor betydelse i offentliga vårdinrättningar 10 och en kontraindikation för lungtransplantation 11.

M. abscessus visar släta (S) eller grova (R) koloni morphotypes som leder till olika kliniska resultat. I motsats till S-stammen, R bakterier har en tendens att växa ände mot ände, vilket leder till ett rep eller en lina liknande struktur 12,13. Flera oberoende studier baserade på antingen cellulära eller djurmodeller avslöjade hyper virulens fenotyp av R morphotype 14,15. Från epidemiologiska studier, de mest allvarliga fallen av M. abscessus lunginfektioner verkar vara förknippade med R-varianter 16 som är den enda variant somhar sett att bestå i flera år i en infekterad värd 3. Den morphotype skillnaden är beroende av närvaro (i S) eller förlust (i R) av ytan associerade glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund av de inneboende begränsningarna hos de för närvarande tillgängliga cellulära / djurmodeller för att studera M. abscessus infektion, vår kunskap om de patofysiologiska händelser R eller S-varianter förblir oklar. Infektion av immunkompetenta möss via intravenösa eller aerosoler vägar leder till övergående kolonisation, hindrar användningen av möss för att studera ihållande infektioner och för in vivo drogresistensbestämning 17. Därför utvecklar djurmodeller kan bli föremål för manipulation av värdsvaret är en stor utmaning. I detta sammanhang har icke-däggdjurs modeller infektions nyligen utvecklats, inklusive Drosophila melanogaster 18 som erbjuder flera fördelar såsom kostnad, snabbhet och etiska godtagbarhet over musmodellen. Zebrafisk (Danio rerio) modell av infektion har även undersökts för att visualisera, icke-invasiv bildbehandling, utvecklingen och kronologi över M. abscessus infektion hos ett levande djur 19. Det är viktigt att en proof of concept konstaterades också att visa sin lämplighet för antibiotika bedömningar in vivo mot M. abscessus 17,20.

Zebrafisk har använts i stor utsträckning under de senaste två decennierna för att studera samspelet mellan olika patogener och värdens immunsystem 21. Den ökande framgången för denna alternativa ryggradsdjur modell bygger på stora och unika möjligheter som motiverade och validerade dess användning för en bättre förståelse av många virus- och bakterieinfektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Till skillnad från de flesta andra djurmodeller, zebrafisk embryon är optiskt transparenta, vilket gör att icke-invasiv fluorescens avbildning 30. Detta utmärs ledde till studera M. abscessus infekterade zebrafisk embryon med oöverträffade detaljer, som kulminerade med beskrivningen av extracellulära ligt, som representerar ett exempel på bakteriell morfologisk plasticitet. Cording representerar en ny mekanism för underminering av immunsystemet och en nyckelmekanism främja patogenes av akut M. abscessus infektion 19.

Denna rapport beskriver nya verktyg och metoder med hjälp av zebrafisk embryot att dechiffrera patofysiologiska drag av M. abscessus infektion och att studera intima samspelet mellan baciller och det medfödda immunförsvaret. Först, en detaljerad mikroinjektion protokoll som inkluderar hanterande av den bakteriella ympen, embryo förberedelser, och infektion i sig, presenteras. Metoder särskilt anpassat för att bedöma M. abscessus virulens genom att mäta olika parametrar, såsom värd överlevnad och bakteriell belastning, presenteras. Särskilt fokus ges på huratt övervaka, vid en spatiotemporal nivå, ödet och progression av infektionen och värdens immunsvar på M. abscessus hjälp av video mikroskopi. Dessutom, för att undersöka bidrag och roll makrofager under M. abscessus infektion, metoder generera makrofager-utarmat embryon (med antingen genetically- eller kemiskt baserade metoder) beskrivs. Slutligen protokoll visualisera specifika interaktioner med makrofager eller neutrofiler använder antingen fasta eller levande embryon dokumenteras.

Syftet med denna rapport är att stimulera ytterligare undersökningar för att kasta nytt ljus i M. abscessus virulens mekanismer och särskilt den roll som ligt i upprättandet av en akut och okontrollerad infektionsprocessen.

Protocol

Zebrafisk experimentella procedurer måste uppfylla de relevanta institutionella och statliga regleringar. För den aktuella studien har zebrafisk experiment gjordes vid universitetet Montpellier, enligt EU: s riktlinjer för hantering av försöksdjur (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) och godkänts under beteckningen CEEA-LR-13007. 1. Beredning av reagenser och mikroinjektion Equipment Förbered fisk vatten genom att lösa 0,06 g Direkt Ocean Hav…

Representative Results

Även olika anatomiska platser kan injiceras 32, är kaudalvenen injektioner ofta används för att generera systemisk infektion för efterföljande analyser inklusive överlevnad experiment, bakteriell belastning beslutsamhet, fagocytos aktivitet eller sladd bildning. Injektioner i svansmusklerna används för att bedöma rekryteringen av makrofager på platsen för injektion (figur 3A). För att undersöka och jämföra virulens R- och S-varianter av M. abscessus är fluorescerande…

Discussion

Den zebrafisk har nyligen dykt upp som en utmärkt ryggradsdjur modellsystem för att studera dynamiken i bakteriell infektion med hjälp av brett fält och konfokal avbildning i realtid 36. Kombinationen av spridda mykobakteriella suspensioner (protokoll 2.2) tillsammans med mikroinjektion metoder (protokoll 4) medger reproducerbara systemiska infektioner, och efterföljande övervakning och visualisering av utvecklingen av infektion med en särskild inriktning på de bakteriella interaktioner med värdmakro…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna är tacksamma till K. Kissa för hjälpsamma diskussioner och för att åstadkomma lipo-klodronat och L. Ramakrishnan för den generösa gåvan av pTEC27 och pTEC15 som tillåter uttryck av tdTomato och Wasabi, respektive. Detta arbete är en del av projekten i den franska nationella forskningsinstitut (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 och DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) och Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) enligt bidragsavtal nr. PITN-GA-2011-289209 för Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vill också tacka Association Gregory Lemarchal och Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) för att finansiera CM Dupont.

Materials

BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -. L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -. R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -. L., Reyrat, J. -. M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -. L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -. L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -. T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -. H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -. L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -. P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -. A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

ZebrafishMycobacterium AbscessusInfection ModelHost-pathogen InteractionsFluorescent BacteriaMacrophagesCordingAbscess FormationVirulenceImagingFluorescence Microscopy
check_url/pt/53130?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image