Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening
Summary
Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.
Abstract
Nós desenvolvemos uma plataforma de rastreio para identificar proteínas quinases específicas de substratos fosforilados humanos que podem ser utilizados para elucidar novas vias de transdução de sinal. A nossa abordagem apresenta a utilização de uma biblioteca de proteínas quinases humano marcado com GST purificada e um substrato da proteína recombinante de interesse. Usámos esta tecnologia para identificar MAP / microtúbulo-regulação afinidade quinase 2 (MARK2) como a quinase para um local regulada por glucose, em reguladas pela CREB transcricional coativador 2 (CRTC2), uma proteína necessária para a proliferação das células beta, assim como a família de tirosina-quinases Axl como reguladores de metástases de células por fosforilação da proteína adaptadora ELMO. Descrevemos essa tecnologia e discutir como ela pode ajudar a estabelecer um mapa abrangente de como as células respondem a estímulos ambientais.
Introduction
Proteína modificações pós-traducionais (PTMs) são essenciais para a comunicação intracelular. Talvez o melhor estudada de todas as PTMs fosforilação é catalisada por proteínas quinases, que regulam uma miríade de funções de proteínas, incluindo a sua actividade bioquímica, localização subcelular, conformação, e a estabilidade. A identificação de sítios de fosforilação de proteínas alvo pode ser realizada através de mapeamento triptico fosfopéptido ou por técnicas-padrão de proteómica agora utilizando amostras enriquecidas para péptidos fosforilados 1,2. Enquanto três quartos do proteoma expressas são esperados para ser fosforilada 3 e um identificado 200.000 locais de fosforilação 5, com estimativas de até 1 milhão de 6, muitos deles não têm atribuído biologia, via de sinalização, ou proteína quinase.
Enquanto identificação de locais fosforilados é relativamente simples, uma comparativamente maior desafio éidentificar a cinase cognato (s) que tem como alvo estes locais, um processo que nos referimos como mapeamento de quinase: substrato pares. Várias abordagens para a identificação de quinase: substrato pares foram descritas, começando com uma quinase de interesse e procurando os seus substratos, ou a partir de um substrato de interesse e a tentativa de encontrar um modificador quinase 7-11 experimentalmente ou computacionalmente 12. Para identificar quinases para um substrato fosforilado conhecido, bioinformática pode ser usado para identificar proteínas que contêm uma sequência conservada curto de aminoácidos que flanqueiam o resíduo fosforilado (o local de consenso), bem como a identificação de quinases que formam um complexo com o substrato precipitável. No entanto, estas abordagens são demorados e muitas vezes não cumprem com sucesso.
Nós desenvolvemos uma abordagem funcional sistemático para identificar rapidamente quinases que fosforilam pode um determinado substrato 13. O ensaio tela produz excelente específicodade, com a seleção muito clara para os potenciais quinases cognatas. Dada a centralidade da fosforilação de sinalização biológica, a tela é útil para a descoberta em praticamente todos os celulares vias de sinalização 14-16. A tela envolve a realização de um ensaio de quinase em larga escala com uma biblioteca de proteínas quinases humanos. As cinases foram marcados com glutationa bacteriano S-transferase (GST) de proteínas e são purificados a partir de extractos de células de mamíferos, o que significa que as enzimas recombinantes – ao contrário do que as preparadas a partir de bactérias – são gerados na presença das proteínas quinases a montante muitas vezes necessários para a enzimas recombinantes para ter actividade in vitro. Com efeito, enquanto que a actividade da cinase de serina, treonina e tirosina necessária para a activação a jusante de quinase estão presentes na levedura 10, o genoma da levedura codifica 122 cinases de proteína, indicando que o kinome de mamífero, com mais de 500 genes 17, tornou-se significativamente mais complexa, a fim de regulate os processos originais para os organismos de ordem mais elevada. Além disso, o efeito de diferentes estímulos relevantes para a biologia celular e doença humana (tal como pequenas moléculas, factores de crescimento, hormonas, etc.) podem ser usados para modular a actividade de quinase 14,15 num contexto apropriado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma vez que as publicações originais que descrevem a abordagem 14,15, a biblioteca original de 180 GST-quinases foi ampliada para 420 membros, ou ~ 80% do kinome proteína humana. Com a biblioteca ampliada, o protocolo conforme descrito leva 4-5 dias e, em seguida, 1-4 dias para desenvolver filmes (como necessário), o que pode ser encurtado através da utilização de imagiologia com fósforo e o aumento do sinal digital. Há várias etapas-chave em que os cuidados devem ser tomados (veja …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão NSERC 386634. Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Screaton para discussões úteis.
Materials
| Lysis buffer | Made in house | See Protocol step 1.1 | |
| 10x kinase buffer | Made in house | See Protocol step 1.2 | |
| 10x M-ATP | Made in house | See Protocol step 1.3 | |
| Human kinase plasmids | Orfeome, Invitrogen, Origene | GST-tagged in house | |
| 96 well plates | Fisher Scientific | CS003595 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| DMEM | Fisher Scientific | SH3002201 | supplement with 100U/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin, 10% fetal calf serum. |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | |
| 15 cm cell culture dishes | Fisher Scientific | 877224 | |
| Reduced serum medium | Invitrogen | 22600-050 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Automated liquid dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small cassette attachment | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Standard cassette attachment | Thermo Scientific | 14072670 | |
| 4mM pervanadate | Made in house | See Protocol step 3.1 | |
| 0.25 M CaCl2 | Made in house | ||
| Multichannel pipette (20-200 uL) | Labnet | p4812-200 | |
| Multichannel pipette (1-10 uL) | Thermo Scientific | 4661040 | |
| V-bottom 6-well plates | Evergreen Scientific | 290-8116-01V | |
| Glutathione coated 96-well plates | Fisher Scientific | PI-15240 | |
| Hybridization oven | Biostad | 350355 | |
| GST tagged substrate | Made in house | ||
| Myelin Basic Protein (MBP) | Sigma | M1891 | |
| Repeater pipette (1 mL) | Eppendorf | 22266209 | |
| 32P gamma-ATP | Perkin Elmer | BLU502Z500UC | |
| 2X SDS lysis buffer (100 mL) | Made in house | See Protocol step 1.4 | |
| 26-well precast TGX gels | BioRad | 567-1045 | gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest |
| Coomassie stain | Made in house | 0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol | |
| Coomassie destain | Made in house | 10% acetic acid, 20% methanol | |
| Labeled gel containers | Made in house | Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel | |
| Whatman filter paper | Fisher Scientific | 57144 | |
| Cellophane sheets (2) | BioRad | 165-0963 | |
| Gel dryer | Labconco | 4330150 | |
| Double emulsion autoradiography film | VWR | IB1651454 | |
| Film cassette | Fisher Scientific | FBAC-1417 | |
| Intensifying screen | Fisher Scientific | FBIS-1417 | |
| Plate sealing rubber roller | Sigma | R1275 |
Referências
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