광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징
Summary
세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.
Abstract
베타 아밀로이드 (Aβ)는 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 발견 노인반의 주요 구성 성분이다. Aβ는 β 및 γ – 세 크레타에 의해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차적 분열에서 파생됩니다. AD 병리에 Aβ의 중요성에도 불구하고, 이러한 분열의 세포 내 현지화가 잘 확립되어 있지 않습니다. 우리 실험실에서 직장 및 다른 세포 표면에서 내재화 후 APP 처리에 엔도 솜 / 리소좀 시스템 연루. 그러나, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 상대적으로 파악 하였다입니다.
세포 표면 단백질은 많은 라벨링 기술에 수정할 수있는 반면, 골지체에서 막 단백질의 거래를위한 다음의 간단한 방법은 없다. 이를 위해, 우리는 C- 말단에서 사진 기동 GFP (paGFP)로 태그 한 응용 프로그램 구조를 만들었습니다. 합성 후 paGFP 낮은 기저 형광을 가지고 있지만 413 nm의 빛을 t로 자극 될 수있다O 강한, 안정적인 녹색 형광을 생산하고 있습니다. 사용하여 골지 마커 락토 트랜스퍼 대상 시안 형광 단백질 (GALT-CFP)에 결합 된, 우리는 트랜스 골지 네트워크 APP photoactivate 정확하게 할 수있다. 이 형광 식별 하류 구획 (트래픽) 초기 엔도 좀 (Rab5), 후반 엔도 좀 (Rab9)와 리소좀 (램프 1)에 대한 구획 마커 단백질 태그로 사진 활성화 APP-paGFP은 다음에 할 수 있습니다. 또한, 클로로퀸 또는 γ 세 크레타 제 억제제 인 L685, 458을 포함 APP 처리에 억제제를 사용하여, 우리는 단일 세포에서 APP의 프로세싱을 조사 펄스 추적 실험을 수행 할 수있다.
우리는 APP의 많은 부분이 세포 표면에 나타나는없이 리소좀에 빠른 속도로 이동 한 다음 세 크레타 같은 분열에 의해 리소좀에서 삭제되는 것을 찾을 수 있습니다. 이 기술은 이리저리 세포 내 단백질의 인신 매매 및 처리를 다음과 같은 사항에 대해 paGFP의 유틸리티를 보여줍니다하류 구획 골지을 해요.
Introduction
알츠하이머 병 (AD)의 특징은 노인성 플라크와 뇌의 신경 섬유 엉킴 (NFTS)의 존재이다. 노인성 플라크의 주성분은 β – 아밀로이드 (Aβ)입니다. Aβ는 그 전구체에서 파생 된; 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 1. 응용 프로그램의 아밀로이드 분열은 β-크레타 제 2에 의해 APP에서 ectodomain의 제거를 시작합니다. 남은 잔류 물을 99 카복실 말단 단편 (CTF)는 Aβ 3-7을 생산하는 γ 세 크레타 제에 의해 절단 될 수있다. 많은 실험 엔도 솜 / 리소좀 시스템으로 세포 표면에서 내재화 후 세포 표면 APP의 분열을 설명하고 있지만, 최근 다수의 연구는 APP의 세포 트래 피킹 또한 그 처리 8-11을 조절하는데 중요하다는 것을 제안 하였다.
γ 크레타 제 저해제 및 아밀로이드 베타 immun으로 Aβ의 수준을 조절에서 시도의 숫자가 있었다otherapies. 그러나, 이들 치료법에 대한 최근의 임상 시험은 경우에 피해를 야기 12, 더 유익 없었다하고. 아밀로이드 베타의 생산을 조절하는 개발되지 않은 전략은 APP의 하위 세포 현지화 및 γ-크레타 제의 상호 작용을 변경하는 것입니다. 골지, 세포막, 그리고 엔도 좀 / 리소좀은 모든 APP의 γ-절단 가능한 로케일로 제안되었다. 우리의 실험실에서 연구 APP 및 γ-크레타 제는 리소좀 막 (13)의 거주자 단백질이 있음을 시사한다. 또한, 우리는 리소좀 γ 크레타 제는 산성 최적의 pH (13)를 가지고 있음을 발견했다. 또한, 클로로퀸 또는 NH 4 CL와 엔도 솜 / 리소좀 시스템의 알칼리화, Aβ (14)의 생성을 감소하는 것으로 나타났다. -γ 크레타 제 억제 또는 녹아웃 또는 프레는 리소좀 15-17에서 APP-CTFs 축적으로 이어집니다. 또한, 응용 프로그램 엔도 시토 시스를 방해하는 Aβ 생산 18 ~ 20을 낮 춥니 다.
초기 단백질과 엔도 솜 / 리소좀 시스템에서 재활용 단백질 정렬 역으로 골지의 중요성에도 불구하고, 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매는 세부 (21)에 연구되지 않았다. 최근 작품은 앱이 retromer 단지와의 상호 작용을 통해 트랜스 골지 네트워크 (TGN)로 재순환 될 수 있음을 보여 주었다. retromer 단지의 다운 규제는 Aβ 생산 8,22-24을 감소시킨다. 그러나, 골지에서 응용 프로그램의 출구는 잘 연구되지 않았다.
이러한 트랜스페린 수용체로 세포 표면 단백질의 세포 내 이입을 다음 있지만, 쉽게 표시 및 준수, 세포 내 단백질의 인신 매매를 따라하는 것은 더 어렵습니다. 사실, 몇 가지 단백질은 세포 내 인신 매매는 몇 군데 있었다. 이러한 사진 기동-GFP (paGFP), 형광 단백질 태그의 출현은 세포 내 인신 매매를 조사하기위한 새로운 도구를 제공하고 있습니다. 사진 – 기동-GFP는 GF의 한 형태이다합성 후 거의 보이지이지만, 413 nm의 레이저 광에 의해 활성화 된 후에 강한 녹색 (GFP)의 형광을 개발하고이 신호 (25, 26) 일 동안 안정하다 P. paGFP를 사용 제물 리소좀 단백질 intralysosomal 매매를 입증하는 데 사용 된 막 단백질 1 (LAMP1) (25), 소낭 구내염 바이러스 당 단백질 (VSVG, 분비 경로의 마커) (27)의 세포 표면에 전달하고, 퍼 옥시 솜의 회전율 28 및 29 autophagosomes.
생균에 TGN에서 APP의 정렬을 가시화하기 위해, 우리는 C 말단에 광 활성화 가능한 (paGFP)에 결합 APP의 마지막 112 아미노산을 발현하는 플라스미드를 설계 (30) (βAPP-paGFP라고 함). 우리는 또한 전체 길이 응용 프로그램과 함께 이러한 실험을 수행하고 비슷한 결과를 달성했다; 그것은 밝은 이미지를 제공하기 때문에 ΒAPP 구조가 여기에 사용됩니다. 우리는 다음 사진을 활성화 &# 946;에만 TGN에서 APP-paGFP, TGN 마커 갈 락토 (GALT)에 의해 경계가있다. 앱이 핵 주변 지역에서 빠른 축삭 앱의 운송 및 통관을 시각화 paGFP 태그되었지만,이 하나 신중하게 정의 함에서 다른 11,31,32에 응용 프로그램 매매의 첫 번째 데모입니다. 여기서 우리는 정확한 TGN 내 사진 활성화 및 다운 스트림 구획과 리소좀 (30) 후속 절단 및 통관에 응용 프로그램의 출구를 보여줍니다. 골지 내의 정확한 광 – 활성화 단백질은 다른 시스템에 널리 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 기술은 후속 매매 및 분열을 시각화 TGN에 paGFP 태그 막 단백질의 정확한 광 활성화를 설명한다. paGFP 25 일 전 십 년간 생성 된 반면,이 하류 구획에 초기 단백질의 인신 매매를 수행하는 정확한 사진 활성화의 첫 번째 예입니다. APP-paGFP를 사용하여 이전의 연구 사진을 활성화 골지 (11)로 간주 된 세포의 요정 핵 영역을 구성한다. 그러나, 우리의 현미경 사진, 리소좀, 초기 엔?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
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