Photoactivatable GFP ile APP Hücre içi Ticareti Görüntüleme
Summary
Hücre yüzey proteinlerinin nakil nispeten kolay çalışılan birlikte, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı görselleştirme çok daha zordur. Burada, biz fotoaktıfleştırılebılır GFP içeren yapıları kullanmak ve doğru aşağı akım bölmelerine Golgi aygıtı gelen amiloid öncü proteinin izleyin ve açıklığını takip etmek bir yöntem ortaya koymaktadır.
Abstract
Beta-amiloid (Aβ) Alzheimer hastalarının beyinlerinde bulunan senil plakların temel bileşenidir. Aβ p ve γ-sekretazlar Amiloid Prekürsör Protein (APP) sıralı bölünmesinden türetilmiştir. AD patolojiye Aβ önemine rağmen, bu bölünmeler hücre içi lokalizasyonu iyi kurulmuş değil. Laboratuvarımızda çalışmak ve diğerleri hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra APP işleme endozomal / lizozom sistemini ima. Bununla birlikte, APP'nin hücre içi nispeten örüntüsü oldukça olup.
Hücre yüzey proteinleri birçok markalama tekniklerine düzeltilebilir olanı olsa da, Golgi zar proteinlerinin kaçakçılığı aşağıdaki için basit bir yöntem vardır. Bu amaçla, C-terminalinde foto-aktifleştirilebilen bir GFP (paGFP) etiketlenen APP yapıları oluşturulur. Sentezden sonra, paGFP düşük taban floresans sahiptir, ancak 413 nm ışık t uyarılabiliro güçlü, istikrarlı bir yeşil floresan üretir. Kullanarak Golgi markör galaktosil transferaz, bir hedef olarak Cyan Floresan Protein (GaIT-CFP) bağlanmış biz trans-Golgi ağı doğru olarak photoactivate APP edebiliyoruz. Bu floresan ile tanımlanan alt bölmelere trafiğini ilk endozoma (Rab5), geç endozom (Rab9) ve lizozom (LAMP1) için bölmesi markör proteinlerin etiketlenmiş olarak fotoaktif APP-paGFP daha sonra takip edilebilir. Bundan başka, klorokin ve γ-sekretaz inhibitörü L685, 458 de dahil olmak üzere APP işleme önleyiciler kullanılarak, tek hücreler içinde APP dönüşümünü incelemek için darbe kovalayıcı deneyler gerçekleştirmek mümkündür.
Biz APP büyük bir kısmı hücre yüzeyinde görünen olmadan lizozoma hızla hareket eder ve daha sonra sekretaz benzeri çatlamalarla lizozoma temizlenir bulabilirsiniz. Bu teknik fro hücre içi proteinlerin kaçakçılığı ve işlenmesini takip için paGFP kullanımını gösteriraşağı bölmeleri golgi m.
Introduction
Alzheimer hastalığı (AD), ayırt edici senil plakların ve beyinde nörofibriler yumakların (NFTler) varlığıdır. Yaşlılık plaklarının ana kurucu β-amiloid (Aβ) 'dir. Aβ kendi öncüsünden elde edilir; amiloid öncü proteini (APP) 1. APP Amiloidojenik bölünme β-sekretaz 2 ile APP ektoalan uzaklaştırılması ile başlar. Geri kalan 99 kalıntılı bir karboksil terminal parçası (CTF) Aβ 3-7 üretilmesi için γ-sekretaz ile bölünebilen. Birçok deneyler endozomal / lizozomal sistemine hücre yüzeyinden içselleştirilmesi sonra hücre yüzeyi APP bölünme belgelenmiş olmasına rağmen, son çalışmalar çok sayıda APP hücre içi ticareti, aynı zamanda işleme 8-11 düzenlenmesinde önemli olduğunu ileri sürmüşlerdir.
Γ-sekretaz inhibitörleri ve Aβ Immun ile Aβ düzeylerini modüle girişimleri bir dizi olmuşturotherapies. Bununla birlikte, bu tedaviler ile son klinik çalışmalarda bazı durumlarda, zarar 12 neden olduğu, hiç bir yarar gösteren, vb. Aβ üretimini modüle etme bir atıl bir strateji APP alt-hücresel lokalizasyon ve γ-sekretaz etkileşimi değiştirmektir. Golgi plazma membranı ve endozomlar / lizozom Tüm APP γ-bölünmesi için mümkün olan yerel olarak önerilmiştir. Laboratuvarımızda yapılan araştırmalar APP ve γ-sekretaz lizozomal zarın 13 yerleşik proteinler olduğunu göstermektedir. Ayrıca, lızozomal γ-sekretaz bir asidik pH değerine uygun 13 sahip olduğunu bulduk. Buna ek olarak, klorokin ve NH4CI ile endozomal / lızozomal sisteminin alkalizasyon, Aβ 14 üretimini azalttığı gösterilmiştir. -y olan sekretaz engellenmesi veya nakavt veya Presenilin lizozom 15-17 APP-CTFS birikimine yol açar. Ayrıca, APP endositoz kesintiye Aβ üretimi 18-20 düşürmektedir.
Doğmakta olan proteinler ve endozomal / lizozomal sisteminden geri dönüştürülmüş proteinler için bir sıralama istasyonu olarak Golgi önemine karşın, APP hücre içi ticareti detaylı 21'de çalışılmamıştır. Son çalışmalar, APP retromer kompleksi ile etkileşim yoluyla trans-Golgi ağı (TGN) geri edilebilir olduğunu göstermiştir. Retromer kompleksinin Aşağı regülasyon Aβ üretimi 8,22-24 azalır. Ancak, Golgi dan APP'nin çıkış iyi çalışılmamıştır.
Örneğin transferrin reseptörü gibi hücre yüzey proteinleri, endositozu takip ederken, kolayca etiketli ve takip edilmesini, hücre içi proteinlerin kaçakçılığı, aşağıdaki daha zordur. Aslında, birkaç proteinler, hücre içi ticareti görüntülü vardı. Bu tür fotoğraf aktifleşebilen-GFP (paGFP) gibi floresan protein etiketleri, gelişi içi ticaretini incelemek için yeni araçlar sağladı. Foto-aktive olan GFP-GF şeklidirSentezden sonra neredeyse görünmez, ancak 413 nm lazer ışığı ile aktive edildikten sonra güçlü yeşil (GFP) floresan geliştirir ve bu sinyal gün 25,26 stabildir P. PaGFP kullanılarak yapılar Lizozomal Protein intralizozomal kaçakçılığı göstermek için kullanılmıştır zar proteini 1 (LAMP1) 25, Vesicular Stomatitis virüsü glikoproteini (VSVG, salgı yoluna bir belirteci) 27 hücre yüzey teslimat ve peroksizom ciro 28 ve 29 autophagosomes.
Canlı hücrelerdeki TGN APP'nin sıralama görselleştirmek amacıyla, C-terminali foto-aktifleştirilebilen (paGFP) bağlanmış APP'nin son 112 amino asidini ifade plazmidi olarak tasarlanmış 30 (βAPP-paGFP olarak da adlandırılır). Ayrıca, tam uzunlukta APP bu deneyleri ve benzeri sonuçlar elde ettik; daha parlak görüntüler sağlar çünkü ΒAPP yapı burada kullanılmıştır. Daha sonra fotoğraf-activate &# 946; sadece TGN APP-paGFP, TGN işaretleyici galaktosiltransferaz (GalT) tarafından sınırları çizilmiş olarak. APP perinükleer bölgeden hızla aksonal APP taşınmasını ve temizlenmesini görselleştirmek için paGFP ile etiketlendi olmasına rağmen, bu bir dikkatle tanımlanmış bölmeden başka 11,31,32 APP ticaretinin ilk göstergesidir. Burada, biz doğru TGN içinde foto-aktivasyonu ve aşağı bölmeleri ve lizozomlar 30 sonraki bölünme ve açıklık içine APP çıkışını göstermektedir. Golgi içinde doğru fotoğraf etkinleştirme diğer protein sistemleri yaygın olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik daha sonraki ticareti ve bölünme görselleştirmek için TGN içinde paGFP ile etiketlenmiş membran proteinlerinin doğru fotoğraf aktivasyonunu açıklar. PaGFP 25 on yıl önce yaratılmış iken, bu aşağı bölmelere doğmakta proteinlerin kaçakçılığını takip etmek doğru fotoğraf aktivasyon ilk örneğidir. APP-paGFP kullanılarak önceki çalışmalar, fotoaktif Golgi 11 olduğu kabul edildi hücrenin bir peri-nükleer bölgesini oluşturur. Ancak, mikrograflar, lizozom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.
Materials
| 35-mm glass bottom culture dishes | Matek | P-35G-1.5-20-C | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-092 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| dibutyrl cyclic AMP | Sigma | D0627 | |
| Heat in activated Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Heated Microscopy stage insert P | PeCon GmbH | ||
| Tempcontrol 37–2 digital 2-channel | PeCon GmbH | ||
| Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope | Carl Zeiss | with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser | |
| Zeiss 63× 1.4 numerical aperture oil immersion lens | Carl Zeiss | ||
| L685, 458 | EMD Millipore | 565771 | dissolved in DMSO |
| cholorquine | Sigma | C6628 | dissolved in water |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | dissolved in DMSO |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma | 472301 | |
| Imaris | Bitplane | with colocalization package |
Referências
- Masters, C. L., et al. Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).
- Vassar, R., et al. Beta-secretase cleavage of Alzheimer’s amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science. 286 (5440), 735-741 (1999).
- De Strooper, B., et al. Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).
- Xia, W., et al. Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).
- Li, Y. M., et al. Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).
- Kim, W., Hecht, M. H. Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40. J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).
- Pawar, A. P., et al. Prediction of ‘aggregation-prone’ and “aggregation-susceptible. J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).
- Wen, L., et al. VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer’s disease neuropathology. J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).
- Rogaeva, E., et al. The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease. Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).
- Andersen, O. M., et al. Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).
- Schmidt, V., et al. SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1. J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).
- Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer’s disease: What are the most promising targets. Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).
- Pasternak, S. H., et al. Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane. J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).
- Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein. Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).
- Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives. Science. 255 (5045), 728-730 (1992).
- Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism. Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).
- Chen, F., et al. Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells. J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).
- Perez, R. G., et al. Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42. J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).
- Cirrito, J. R., et al. Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-β In Vivo. Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).
- Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein. BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).
- Traub, L. M., Kornfeld, S. The trans-Golgi network: a late secretory sorting station. Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).
- Vieira, S. I., et al. Retrieval of the Alzheimer’s amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated. Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).
- Sullivan, C. P., et al. Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing. Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).
- Fjorback, A. W., et al. Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing. J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells. Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods. 32 (4), 445-450 (2004).
- Hirschberg, K., et al. Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells. J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).
- Hailey, D. W., et al. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell. 141 (4), 656-667 (2010).
- Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid. Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).
- Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins. Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).
- Herl, L., et al. Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase. Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).
- Lorenzen, A., et al. Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway. Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).
- Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. Metabolism of the ‘Swedish’ amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase”;site occurs in the golgi apparatus. J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).
- Thinakaran, G., Koo, E. H. Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function. J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).
- Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region. Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).
- Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic. 11 (1), 13-22 (2000).
- Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites. J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).
