Levensvatbaarheid van Bioprinted Cellular constructen met behulp van een drie Dispenser cartesiaanse Printer
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
Tissue engineering gebruikt de principes van de biologie en techniek in de ontwikkeling van functionele substituten te behouden, herstellen of versterken natief weefsel en. Het vermogen van het opwekken van drie-dimensionale biomimetische constructen on demand zou wetenschappelijke en technologische vooruitgang in tissue engineering en in cel-gebaseerde sensoren, geneesmiddel / toxiciteitsscreening, weefsel of tumormodellen en andere vergemakkelijken. De driedimensionale organisatie van weefselengineering constructs is een fundamentele component van de fabricagemethode omdat het nauw de zeer georganiseerde interactie van cellen en extracellulaire matrix in natief weefsel moet nabootsen.
Biologisch afbreekbaar en vorm vormende driedimensionale scaffolds zijn kritische factoren bij het genereren van nieuwe weefselconstructen omdat cellen migreren naar een tweedimensionale laag van cellen vormen, maar missen het vermogen te groeien in ontwikkelde driedimensionale. De steiger dient als tijdelijke basis voor cellgehechtheid en proliferatie, dus het moet worden opgebouwd uit materialen met een controleerbare porositeit en biologische afbreekbaarheid, en voldoende mechanische integrit. De scaffold materialen mogen niet cytotoxisch zijn of tot een negatieve reactie van de gastheer. Hydrogels zijn gewoonlijk in tissue engineering technieken en door hun hydrofiliciteit, hydrogels mogelijk vocht en gasuitwisseling gehele structur. Door het combineren van verschillende hydrogels, de eigenschappen van het gesynthetiseerde hydrogel zijn aanpasbaar aan verschillende applicatie eis te voldoen.
De conventionele tissue engineering aanpak omvat de oprichting van acellulaire poreuze offer steigers die zijn ingezaaid met cellen post-fabricatio. Veel technieken zijn toegepast, zoals vezelbinding, oplosmiddelgieten, en smelt vormen, maar bleek minimaal succesvol tissue engineering toepassingen. Vezelbinding methoden toe vezels worden uitgelijnd in bepaalde vormen, maar zijn alleen in staat producing zeer dun schavot. Oplosmiddelgieten werkwijzen geproduceerd zeer poreuze constructies, maar de grootste geproduceerde membraan bedroeg slechts 3 mm thic. Derhalve creëren driedimensionale constructies niet mogelijk met behulp van deze technieken. Melt giettechnieken succesvol gebleken bij het produceren van drie-dimensionale stellage, maar zulke hoge temperaturen nodig die biologische materialen niet tijdens het productieproces kunnen worden opgenomen. Stellingen geënt postfabricage zijn beperkt in hun vermogen om de eisen van tissue engineering voldoen driedimensionale scaffolds te produceren met vooraf gedefinieerde of microstructuren en controleerbaar. Een ander groot probleem met stevige steiger zaaien technologieën is het tekort aan vascularisatie en slechte mechanische.
Bioprinting is sindsdien uitgebreid tot drie dimensies door middel van niet-toxische, biologisch afbreekbare, thermo-reversibele gels om de nadelen van conventionele overwinnen. Een paar van de vaste freeform fabricage techniques momenteel werkzaam zijn laser-assisted bioprinting en inkjetprinters. Laserinstrumenten bioprinting technieken een gepulste laserbron, een trefplaat, en een ontvangend substraat driedimensionale genereren. Echter, deze techniek beperkt door lage doorvoer, lage levensvatbaarheid van de cellen en kan slechts beperkte regeling van gefabriceerde structuren omdat alleen fotoverknoopbaar prepolymeren kunnen worden gebruikt om een verknoopte hydrogel. Inkjetprinten werd ontwikkeld als een contactloze werkwijze die digitale beelddata reproduceert op een substraat door afzetten picoliter inkt. Echter, inkjet printing produceert geen hoge-resolutie construct, construeert ervaring snelle eiwitdenaturatie, en veel van de cellen worden gelyseerd in de afzetting.
Op dit moment zijn er nieuwe additive manufacturing bioprinting methoden ontwikkeld. In deze systemen cellen, eiwitten, groeifactoren en biomimetische hydrogels worden typisch geïntegreerd in matrix materials tijdens het fabricageproces en gelijktijdig neergeslagen terwijl computergestuurde actuators driedimensionale scaffold-based cell beladen constructen die de microarchitectuur van natieve nauw nabootsen genereren. De cel-beladen hydrogels vormen de bioink, die heterogeen kan zijn, die uit meerdere celtypen of homogeen. Additive productiesystemen deposit bioink druppel voor druppel of layer-by-layer via wegwerpspuiten en tips op een computergestuurde stadium kan bewegen in de x, y en z-richtingen. Door middel van computersoftware, kan de architectuur van afgedrukte scaffolds gemakkelijk worden gemanipuleerd afhankelijk van de vereisten van de toepassing. In tegenstelling tot conventionele technieken, kunnen driedimensionale medische technologieën (magnetische resonantie beeldvorming, computer tomografie) in de ontwerpen worden opgenomen genereren patiëntspecifieke construct. Deze werkwijzen ook de mogelijkheid van het produceren gevasculariseerde vervanging toe omdat constructen worden geproduceerd met een hogere lokale celdichtheid, waardoor cel-cel interacties en verbetering van de waarschijnlijkheid van implantatie Surviva.
De Palmetto printer is een maat gebouwde driedimensionale meerdere dispensersysteem programmeerbare robot productiemethoden gebruikt om driedimensionale heterogeen weefselconstructen (figuur 1) te genereren. Het maakt gebruik van een veelheid van materialen in unieke combinaties heterogene structuren te produceren. De initialisatie van de bioprinter is één van de belangrijkste stappen in bioprinting, omdat het stelt u in staat om een verscheidenheid van parameters instellen om de bedrukbaarheid van de bioprinted constructies te optimaliseren.
De bioprinter bestaat uit een batch soort proces opstarten, bediening en afsluiten sequenties gecontroleerd door een Programmable Logic Controller (PLC), die de gebruiker werkt door middel van een interactieve touch-screen bedieningspaneel (figuur 1, A). Om besmetting van bio voorkomenlogische materialen het bioprinter is ingesloten in een positieve-druk poly (methylmethacrylaat) (PMMA) kamer met een hoog rendement deeltjes arrestance (HEPA) -filtered luchtcirculatiesysteem (Figuur 1, B, C). De binnenkant van de printer kan worden gesteriliseerd met behulp van het ingebouwde ultraviolet lichtbronnen (Figuur 1 D). De centrale component van de bioprinter een volledig programmeerbaar positionering robot die reproduceerbaar kan plaats een druppelaar met een nauwkeurigheid van 10 micrometer (Figuur 1 E). Er zijn drie dispensers, die in staat zijn de volumes zo klein 230 nl met behulp van een roterende schroef (figuur 1, F) stort zijn. Ze zijn onafhankelijk programmeerbaar via aparte computers die afdrukparameters bepalen voor elke inrichting (figuur 1 G). Rotary-schroef uitgifte maakt gebruik van de rotatie van een motor aangedreven schroef bioink beneden een spuit en uit de spuit te verplaatsen. Deze dispensers zijn gemonteerd op een pneumatischly gecontroleerde Tool Nest (Figuur 2A, B), zodat de robot dispenser gemonteerd op de Z-as robotarm onder geprogrammeerde controle (Figuur 1, H) schakelaar.
De XYZ robot instructies afdrukken ontvangt vanaf een computer met design software (figuur 1 I). Elk programma bevat doseren locaties, kalibratie routines en-dispenser veranderende protocollen. Het ontwerp van de gegenereerde constructies voornamelijk bestaat uit de XYZ-coördinaten waar elke dispenser materiaal zal storten. De bioprinter bestaat uit twee optische lichtsensoren (figuur 2C) die bepalen de XYZ-coördinaten van de spuit end. Deze sensoren zenden coördinaatgegevens de robot, die deze gebruikt om posities van de dispenser punteinden berekenen. Er is een extra verplaatsing laser (figuur 2D) die een 633 nm diode rode laserstraal van vlekgrootte projecteert 30 x 100 micrometer om afstand te meten met een Accuracy van 0,1 micrometer. Wanneer de bundel sterk gericht de robot bepaalt de Z-afstand van het printoppervlak. Deze meting en de optische lichtsensoren meten van het uiteinde in Z, maakt berekening van accurate Z coördinaten gebruikt om de dispenser tip plaatsen ten opzichte van het afdrukoppervlak. De dispensertips bewegen lateraal en verticaal door de X-as gerichte optische lichtsensor aan de Y- en Z centra, en lateraal door een Y-as sensor naar het midden van de X-as zijn. Het drukoppervlak wordt toegewezen met de formule voor een plat vlak in xyz ruimte: ax + by + cz = d te bepalen waar het oppervlak ten opzichte van de positie van het afgifte-uiteinde. De fase printer (Figuur 1, J) houdt een monster petrischaal tot 80 mm in diameter en gebruikt een recirculerende waterbad tot de ingestelde temperatuur (Figuur 1, K) te handhaven. Stage temperatuur kan worden ingesteld binnen een bereik van -20 en stabiel blijft binnen. Er is een USB camera gemonteerdop de robot Z-arm een vergrote weergave van het afgifte-uiteinde tijdens het drukproces (figuur 1, L) leveren. Er is een tweede camera gemonteerd aan de bovenkant van de kamer interieur dat een compleet beeld van het bioprinter geeft tijdens het drukproces (figuur 1, L).
Een computer-aided design tekening software bepaalt de depositiepatroon en kan de gebruiker stapsgewijs afstand druppels en complexe structuren (figuur 3) genereren. Driedimensionale paden kan handmatig worden gecodeerd in de printer-compatibele design software of een aparte computer-aided design tekensoftware (Figuur 4, tabel 1) geïmporteerd. De printer-compatibele software kunnen variaties van druk parameters zoals de afzetting methode (enkele druppel depositie of continu traject afzetting), driedimensionale geometrie van de paden, depositiesnelheid, afstand tussen de spuit uiteinde en substrate afdrukoppervlak, de tijd aan een individu vallen, en de hoogte storten en snelheid van de spuit wordt opgeheven tussen afzetting van de druppels. Elk programma bevat XYZ doseren locaties, tip kalibratieroutines en-dispenser veranderende protocollen om een steriele omgeving te bieden, zonder tussenkomst van een operator, tijdens het afdrukken. De Programmable Logic Controller (PLC) van de robot ontvangt instructies van de computer waarop het ontwerp-software en controleert de timing van gebeurtenissen uit de externe controllers (bijv, de dispensers). Om dit te doen, de PLC maakt gebruik van een looping mechanisme om de automaten te controleren , robotachtige positionering apparaat, en omgevingsfactoren.
Driedimensionale direct-write bioprinting gebruikmaking van een roterende schroef, vloeistof doseersysteem maakt het proces van het afzetten van cellen efficiënter, nauwkeuriger en eenvoudiger dan eerdere methoden zijn. Deze studie toont de maat gebouwde bioprinter kan genereren cell beladen hydrogel constructies met levensvatbaarheid hoge cel.
Protocol
Representative Results
Discussion
De primaire focus van tissue engineering is om de kloof tussen de tekorten orgel en transplantatie behoeften te overbruggen door het ontwikkelen van biologische substituten te kunnen herstellen, handhaven of verbeteren van inheemse weefsel functio. Dit heeft geleid tot de directe vervaardiging van steigers met een complex anatomisch juiste externe geometrie en nauwkeurige controle over de interne geometr. Driedimensionale bioprinting is een methode voor het genereren van driedimensionale constructies van verschillende m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de regering steun onder Grant No. EPS-0903795 toegekend door de National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI) en Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
Referências
- Langer, R., Vacanti, J. P. . Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Derby, B. Review: Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Kachurin, A. M., et al. Direct-Write Construction of Tissue-Engineered Scaffolds. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 698, 10-1557 (2002).
- Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on the Application of Solid Freeform Fabrication Technology to the Production of Tissue Engineering Scaffolds. European Cells and Materials. 5, 29-40 (2003).
- Yeong, W. Y., Chua, C. K., Leong, K. F. Rapid Prototyping in Tissue Engineering. Challenges and Potential. Trends Biotechnol. 22 (12), 643-652 (2004).
- Landers, R., Pfister, A., Hubner, U., John, H., Schmelzeisen, R., Mulhaupt, R. Fabrication of Soft Tissue Engineering Scaffolds by means of Rapid Prototyping Techniques. Journal of Materials Science. 37 (15), 3107-3116 (2002).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of Hydrogels for Bio–Printing Applications. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101A (1), 272-284 (2013).
- Burg, K. J. L., Boland, T. Minimally Invasive Tissue Engineering Composites and Cell Printing. IEEE Eng Med Biol Mag. 22 (5), 84-91 (2003).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A Review of Trends and Limitations in Hydrogel-Rapid Prototyping for Tissue Engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Khalil, S., Nam, J., Sun, W. Multi–Nozzle Deposition for Construction of 3D. Biopolymer Tissue Scaffolds. Rapid Prototyping Journal. 11 (1), 9-17 (2005).
- Pataky, K., Braschler, T., Negro, A., Renaud, P., Lutolf, M. P., Brugger, J. Microdrop Printing of Hydrogel Bioinks into Three–Dimensional Tissue–Like Geometries. Adv Mater. 24 (3), 391-396 (2011).
- Pati, F., Shim, J. H., Lee, J. S., Cho, D. W. Three-Dimensional Printing of Cell–Laden Constructs for Heterogeneous Tissue Regeneration. Manufacturing Letters. 1 (1), 49-53 (2013).
- Gruene, M., et al. Laser Printing of Three–Dimensional Multicellular Arrays for Studies of Cell–Cell and Cell–Environment Interactions. Tissue Eng. 17 (10), 973-982 (2011).
- Khalil, S., Sun, W. Bioprinting Endothelial Cells With Alginate for 3D Tissue Constructs. J Biomed Eng. 131 (11), 1-8 (2009).
- Xu, T., et al. Hybrid Printing of Mechanically and Biologically Improved Constructs for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biofabrication. 5 (1), 1-10 (2012).
- Zhang, T., Yan, K. C., Ouyang, L., Sun, W. Mechanical Characterization of Bioprinted in vitro Soft Tissue Models. Biofabrication. 5 (4), 1-10 (2013).
- Chung, J. H. Y., et al. Bio–ink Properties and Printability for Extrusion Printing Living Cells. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 1 (7), 763-773 (2013).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The Design of Scaffolds for Use in Tissue Engineering. Part II. Rapid Prototyping Techniques. Tissue Engineering. 8 (1), 1-11 (2002).
- Ferris, C. J., Gilmore, K. G., Wallace, G. G., Panhuis, M. Biofabrication: An Overview of the Approaches Used for Printing of Living Cells. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97 (10), 4243-4258 (2013).
- Lu, L., Mikos, A. G. The Importance of New Processing Techniques in Tissue Engineering. MRS Bull. 21 (11), 28-32 (1996).
- Wake, M. C., Gupta, P. K., Mikos, A. G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 5, 465-473 (1996).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J. Organ Printing: Tissue Spheroids as Building Blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E. Scaffold–free Vascular Tissue Engineering Using Bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Devillard, R., et al. Cell Patterning by Laser–Assisted Bioprinting. Methods Cell Biol. 119, 159-174 (2014).
- Binder, K. W., Allen, A. J., Yoo, J. J. Drop–on–Demand Inkjet Bioprinting: a Primer. Gene Ther Reg. 6 (1), 33 (2011).
- Xu, T., et al. Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures Generated by the Inkjet Printing Method. Biomaterials. 27 (19), 3580-3588 (2006).
- Calvert, P. Inkjet Printing for Materials and Devices. Chem Mater. 13 (10), 3299-3305 (2001).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K. Direct–Write Bioprinting Three–Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 98 (1), 160-170 (2011).
- Li, M. G., Tian, X. Y. A Brief Review of Dispensing–Based Rapid Prototyping Techniques in Tissue Scaffold Fabrication: Role of Modeling on Scaffold Properties Prediction. Biofabrication. 1 (3), 1-10 (2009).
- Bouhadir, K. H., Lee, K. Y., Alsberg, E., Damm, K. L., Anderson, K. W., Mooney, D. J. Degradation of Partially Oxidized Alginate and its Potential Application for Tissue Engineering. Biotechnol Prog. 17 (5), 945-950 (2001).
- Rowley, J. A., Madlambaya, G. Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Smith, C. M., Christian, J. J., Warren, W. L. Characterizing Environmental Factors that Impact Viability of Tissue–Engineered Constructs Fabricated by a Direct–Write Bioassembly Tool. Tissue Engineering. 13 (2), 373-383 (2007).
- Ozbolat, I., Yu, Y. Bioprinting Towards Organ Fabrication: Challenges and Future Trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 691-699 (2012).
- Peltola, S. M., Melchels, F. P., Grijpma, D. W., Kellomaki, M. A. A Review of Rapid Prototyping Techniques for Tissue Engineering Purposes. Annals of Medicine. 40 (4), 268-280 (2008).
- Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv Mat. 25 (36), 5011-5028 (2013).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D Bioprinting of Tissues and Organs. Nat Biotech. 32 (8), 773-785 (2014).
- Jia, J., et al. Engineering Alginate as Bioink for Bioprinting. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4323-4331 (2014).
- Forty, R. A., Steinberg, M. S. The Differential Adhesion Hypothesis: a Direct Evaluation. Biologia do Desenvolvimento. 278 (1), 255-263 (2005).
- Wang, L., Shansky, J., Borselli, C., Mooney, D., Vandenburgh, H. Design and Fabrication of a Biodegradable, Covalently Crosslinked Shape–Memory Alginate Scaffold for Cell and Growth Factor Delivery. Tis Eng Part A. 18 (19-20), 2000-2007 (2012).
- El–Sherbiny, I. M., Yacoub, M. H. Hydrogel Scaffolds for Tissue Engineering: Progress and Challenges. Global Cardiology Science, & Practice. 3 (38), 316-342 (2013).
- Smith, C. M., et al. Three–Dimensional BioAssembly Tool for Generating Viable Tissue-Engineered Constructs. Tissue Engineering. 10 (9–10), 1566-1576 (2004).
- Ozbolat, I. T., Chen, H. Development of a ‘Multi-arm Bioprinter’ for Hybrid Fabrication of Tissue Engineering Constructs. Robotics and Computer–Integrated Manufacturing. 30 (3), 295-304 (2014).
- Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A. Three-Dimensional Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell–Laden Tissue Constructs. Adv Mater. X. Adv Mater. X, x-y (2014).
