Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre
Summary
A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.
Abstract
Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.
Introduction
L'ingegneria dei tessuti utilizza i principi della biologia e ingegneria nello sviluppo di sostituti funzionali a mantenere, ripristinare o migliorare tessuto nativo e. La capacità di generare costrutti biomimetici tridimensionali su richiesta faciliterebbe progressi scientifici e tecnologici in ingegneria dei tessuti, così come nei sensori basati su celle, droga / proiezione tossicità, modelli di tessuto o di tumore, e altri. L'organizzazione tridimensionale dei costrutti tissutale è un componente fondamentale del metodo di fabbricazione perché deve strettamente mimare l'interazione altamente organizzato di cellule e matrice extracellulare in tessuto nativo.
Scaffold tridimensionali biodegradabili e di forma che formano sono fattori critici nel generare nuovi costrutti di tessuto perché le cellule migrano per formare uno strato bidimensionale di celle, ma non hanno la capacità di crescere in favorita tridimensionale. L'impalcatura serve come base temporanea per cellulareattaccamento e la proliferazione, quindi deve essere costruito con materiali porosi controllabile e biodegradabilità, e sufficiente integrit meccanica. I materiali scaffold non dovrebbero essere citotossici o creare una risposta avversa dall'host. Gli idrogel sono stati comunemente usati nelle tecniche di ingegneria tissutale, e per la loro idrofilia, gli idrogel consentire scambio fluido e gas in tutta la structur. Grazie alla combinazione di diverse idrogeli, le proprietà del idrogel sintetizzato sono modificabili per soddisfare le richieste di applicazione distinti.
L'approccio di ingegneria tissutale convenzionale prevede la creazione di acellulari scaffold sacrificali porosi che sono seminati con cellule post-fabricatio. Sono state impiegate molte tecniche, come ad esempio la fibra bonding, colata di solvente, e fondere stampaggio, ma rivelato minimamente successo per applicazioni di ingegneria tissutale. Metodi leganti di fibre consentono di fibre da allineare in forme specifiche, ma sono solo in grado di produrre patibolo molto sottile. Metodi di fusione di solventi prodotte costrutti altamente porosi, tuttavia la membrana più grande prodotto è stato solo 3 mm thic. Pertanto, la creazione costrutti tridimensionali non è possibile utilizzando queste tecniche. Tecniche di stampaggio Melt rivelate efficaci nel produrre scaffold tridimensionali, ma tali temperature elevate, sono necessari materiali biologici non possono essere utilizzati nel procedimento di produzione. Ponteggi seminate post-fabbricazione sono limitate nella loro capacità di soddisfare i requisiti di ingegneria dei tessuti per la produzione di scaffold tridimensionali con microstrutture predefinite o controllabili e. Un altro grosso problema con le tecnologie impalcatura seeding solidi è la carenza di vascolarizzazione e poveri meccanico.
Bioprinting è stata estesa a tre dimensioni attraverso l'uso di,, gel termo-reversibile biodegradabili atossici per superare gli svantaggi della convenzionale. Alcuni del solido a forma libera fabbricazione techniques attualmente in fase di impiegati sono bioprinting ea getto d'inchiostro di stampa laser assistita. Tecniche bioprinting laser assistita utilizzano una sorgente laser impulsata, piastra segnale, e un substrato di ricezione per generare tridimensionale. Tuttavia, questa tecnica è limitata a causa della bassa produttività, bassa vitalità cellulare, e può produrre solo disposizioni limitate di strutture fabbricate perché solo prepolimeri photocrosslinkable possono essere utilizzati per formare un idrogel reticolato. Stampa a getto d'inchiostro è stato sviluppato come un metodo senza contatto che riproduce i dati di immagine digitali su un substrato depositando inchiostro picolitri. Tuttavia, la stampa a getto d'inchiostro non produce un'alta risoluzione costrutto, costruisce esperienza rapida denaturazione proteica, e molte delle cellule sono lisati durante la deposizione.
Attualmente, sono stati sviluppati nuovi metodi di produzione di additivi bioprinting. In questi sistemi cellule, proteine, fattori di crescita e idrogel biomimetici sono tipicamente integrati in mater matriceIALS durante il processo di fabbricazione e contestualmente depositata tramite attuatori controllati dal computer per generare costrutti cellulari carichi basati impalcatura-tridimensionali che imitano da vicino la microarchitettura di natale. Gli idrogeli cellule cariche costituiscono il bioink, che può essere eterogenea, costituita da più tipi di cellule, o omogenea. Additivo sistemi produttivi deposito bioink goccia a goccia o layer-by-layer con siringhe monouso e suggerimenti su una fase controllata da computer in grado di muoversi nelle direzioni x, ye z. Attraverso software, l'architettura di scaffold stampati può essere facilmente manipolato a seconda delle esigenze dell'applicazione. A differenza delle tecniche tradizionali, tecnologie mediche tridimensionali (risonanza magnetica per immagini, tomografia computerizzata) possono essere incorporati nei disegni, generando costrutto paziente-specifici. Questi metodi consentono anche la possibilità di produrre sostituzioni vascolarizzati perché costrutti sono prodotti con un più alto ldensità cellulare Ocal, permettendo interazioni cellula-cellula e migliorare la probabilità di post-impianto Surviva.
La stampante Palmetto è personalizzato costruito un sistema multi-dispenser tridimensionale che utilizza metodi di fabbricazione robotizzati programmabili per generare costrutti eterogenei tessuto tridimensionale (Figura 1). Esso consente l'utilizzo di una pluralità di materiali in combinazioni uniche per produrre strutture eterogenee. L'inizializzazione del bioprinter è uno dei passi più importanti nella bioprinting perché permette di impostare una serie di parametri per ottimizzare la stampabilità dei costrutti bioprinted.
Il bioprinter comprende un processo di tipo batch con avvio, uso e arresto sequenze controllati da un controllore logico programmabile (PLC), che l'utente opera attraverso un pannello di controllo touch screen interattivo (Figura 1, A). Per impedire la contaminazione biomateriali logici il bioprinter è racchiuso in un poli positivo-pressione (metilmetacrilato) (PMMA) camera con un arrestance particelle ad alta efficienza (HEPA) -filtered sistema di circolazione dell'aria (Figura 1, B, C). L'interno della stampante può essere sterilizzato usando le fonti di luce ultravioletta incorporate (Figura 1, D). Il componente centrale del bioprinter è un posizionamento robot completamente programmabile che può riproducibile collocare il puntale dispenser con una precisione di 10 micrometri (Figura 1, E). Ci sono tre dispenser, che sono in grado di depositare volumi piccoli come 230 nl utilizzando una vite rotante (Figura 1, F). Essi sono indipendentemente programmabili tramite computer separati che regolano i parametri di stampa per ciascun erogatore (Figura 1, G). Rotary-vite erogazione utilizza la rotazione di una vite motorizzata per spostare bioink giù una siringa e dalla punta della siringa. Questi distributori sono montati su un pneumaticoStrumento Nest controllata ly (Figura 2A, B), che consente al robot di cambiare erogatore montato sul braccio robotico asse Z sotto controllo programmata (Figura 1, H).
Il robot XYZ riceve istruzioni per la stampa da un computer dotato di software di progettazione (Figura 1, I). Ogni programma contiene sedi di erogazione, le routine di calibrazione e protocolli-dispenser che cambia. La progettazione di costrutti generati costituito principalmente le coordinate XYZ dove ogni distributore depositerà materiale. Il bioprinter comprende due sensori ottici ottici (Figura 2C) che determinano le coordinate XYZ della fine punta della siringa. Tali sensori inviano informazioni al robot, che usa per calcolare le posizioni delle estremità punta dell'erogatore coordinate. C'è un laser spostamento supplementare (Figura 2D) che proietta un 633 nm diodo rosso raggio laser di dimensioni dello spot 30 x 100 micrometri per misurare la distanza con un accuracy di 0,1 micrometri. Quando il raggio è altamente focalizzato il robot determina la distanza Z della superficie di stampa. Questa misura, e sensori di luce ottica misurazione della estremità di punta in Z, permette di calcolare accurate Z coordinate usato per posizionare la punta dell'erogatore rispetto alla superficie di stampa. I puntali si muovono lateralmente e verticalmente attraverso il sensore di luce ottica X-asse orientato per trovare i centri Y e Z, e lateralmente attraverso un sensore asse Y per trovare il centro dell'asse X. La superficie di stampa è mappato utilizzando la formula per una superficie piana in spazio xyz: ax + by + cz = d per determinare dove la superficie è relativo alla posizione dell'estremità ago erogatore. La fase di stampa (Figura 1, J) detiene un piatto Petri campione fino a 80 mm di diametro e utilizza un bagnomaria ricircolo per mantenere la temperatura impostata (Figura 1, K). Temperatura di fase può essere impostato in un intervallo compreso tra -20 e rimane stabile all'interno. C'è una fotocamera USB montatasul robot Z-braccio per fornire una vista ingrandita della punta di erogazione durante il processo di stampa (Figura 1, L). Vi è una seconda telecamera montata verso la parte superiore della camera di interni che fornisce una visione completa della bioprinter durante il processo di stampa (Figura 1, L).
Un software di disegno progettazione assistita da computer determina il pattern di deposizione e permette all'utente di generare goccioline incrementale distanziati e strutture complesse (Figura 3). Percorsi tridimensionali possono essere codificati manualmente nel software di progettazione compatibile con stampante o importati da un software separato computer-aided disegno di progetto (Figura 4, tabella 1). Il software compatibile con stampante consente variazioni di parametri di stampa, come il metodo di deposizione (deposizione singola gocciolina o percorso continuo deposizione), la geometria tridimensionale dei percorsi, velocità di deposizione, la distanza tra la fine punta della siringa e substtasso superficie di stampa, la quantità di tempo per depositare una goccia individuale, e l'altezza e velocizzare la siringa viene sollevato tra la deposizione delle gocce. Ogni programma contiene XYZ sedi di erogazione, le routine di calibrazione punta e protocolli-dispenser che cambia per fornire un ambiente sterile, senza l'intervento dell'operatore, durante la stampa. Il controllore logico programmabile (PLC) del robot riceve istruzioni dal computer che esegue il software di progettazione e controlla la temporizzazione degli eventi dai controllori esterni (ad esempio, i dispensatori). Per fare questo, il PLC utilizza un meccanismo di loop per controllare i distributori , dispositivo di posizionamento robotico, e fattori ambientali.
Tridimensionale bioprinting-scrittura diretta utilizzando una vite rotante, sistema di erogazione del liquido permette al processo di deposizione cellule per essere più efficiente, accurato e più facile rispetto ai metodi precedenti. Questo studio dimostra l'bioprinter su misura è in grado di generare cell carico di costrutti idrogel con la vitalità delle cellule di alta.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo principale di ingegneria dei tessuti è quello di colmare il divario tra la carenza di organi e le esigenze di trapianto attraverso lo sviluppo di sostituti biologici in grado di ripristinare, mantenere, o migliorare functio tessuto nativo. Questo ha portato alla realizzazione di ponteggi diretta con un complesso, anatomicamente corretta geometria esterna e controllo preciso sul geometr interna. Bioprinting tridimensionale è una metodologia utilizzata per generare costrutti tridimensionali di varie dime…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal governo sostegno di cui di assegnazione N ° EPS-0903795 assegnati dalla National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), e Grant 8P20 GM103444 (YM PI).
Materials
| Positioning Robot (JR2000 XYZ) | Janome | ||
| Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers | Fishman Corporation | ||
| Optical Light Sensors: | Keyensce | ||
| Displacement Laser: OD Mini | SICK | ||
| Recirculating Water Bath: Polystat | Cole-Parmer | EW-12122-02 | |
| USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP | AnMo Electrionics/YSC Technologies | AD7013MT | |
| Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points | Janome | Comes with purchase of Janome Robot | |
| Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder | RatioServ | Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads | |
| Printer 3 cc Syringes: | Fishman Corporation | 122051 | |
| 22 G Dispenser Tips | Fishman Corporation | Z520122 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Porcine Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Titanium Dioxide | Sigma-Aldrich | 13462-67-7 | |
| Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate) | FMC BioPolymer | 9005-38-3 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Ethylene Glycol | Mallinckrodt Baker, Inc | 9300-01 | |
| Sodium Periodate | Sigma-Aldrich | 7790-28-5 | |
| hADSC | Lonza | PT-5006 | Store in vials in liquid nitrogen until use. |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco Life Technologies | 11965-092 | Warm in 37°C water before use. |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | Warm in 37°C water before use. |
| Calcein AM | Gibco Life Technologies | C3100MP | Store in the dark at -80°C until use. |
| Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | L-3224 | Store in the dark at -80°C until use. |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Sigma-Aldrich | E1769 | 10 G |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium | Life Technologies | 14040133 | Warm in 37°C water before use. |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium | Life Technologies | 14190144 | Warm in 37°C water before use. |
| RGD Peptides | International Peptides | ||
| Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain | Invitrogen Life Technologies | A22283 | Store at -20°C until use |
| (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain | Life Technologies | R37606 | Store at -20°C until use |
Referências
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