Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Förstå de mekanismer genom vilka membranproteiner uppfyller deras cellulära funktion kan ofta vara en utmanande uppgift, eftersom deras verkningsmekanismer är ofta definieras av låg affinitet interaktioner, som är svåra att upptäcka och utvärdera med konventionella biokemiska metoder. Membranproteiner kan vidare höganrikat i specifika membrandomäner 5,6 eller bildar dynamiska högre ordning strukturer, vilket kan i princip ändra deras biologiska aktivitet 7.
Icke-invasiv laser-assisted enda molekyl fluorescensmikroskopi har därmed blivit den metod val att studera protein beteende i komplexa cellulära miljöer. Detta gäller i synnerhet för biokemiska processer som äger rum vid plasmamembranet, eftersom dessa kan i princip övervakas i bullerreducerade total inre reflektion (TIRF) läget. Här provbelysning är begränsad till en upp till 200 nm-tunn skiva i omedelbar närhet av ett glas SUrface, vilket resulterar i en signifikant förlust i cellulär bakgrund och, på grund av egenskaperna hos det evanescenta excitationsljus, också i en väsentlig ökning i fluorescens signalintensiteten 8,9. Båda aspekterna är viktiga när siktar på hög positions och temporal upplösning i en enda molekyl upptäckt.
Planar SLBs är inte bara kompatibel med TIRF mikroskopi. När funktion med lämpliga ligander de ger också direkt tillgång till studera de molekylära dynamiken i cell-celligenkänning som förekommer i immunceller eller andra celler. De kan också enkelt användas för att positionera rörliga och i övrigt icke-vidhäftande celler nära nog till objektglaset så att sådana celler kan avbildas i TIRF belysning, vilket är mycket önskvärt när lednings försök med enda molekyl spårning eller enda molekyl baserad Superresolution. För detta ändamål proteiner måste lastas på en mycket rörlig SLB. En inneboende fördel med den använda li PID är att det inte finns någon ospecifik bindning av proteiner på alla. Dessutom kan SLBs betraktas som tvådimensionella vätskor med en inneboende förmåga att läka sig själva; oegentligheter inom glas stöd kompenseras upp till en viss grad. Ett steg för steg-protokollet är anordnad för att generera mycket rörliga bilayers laddade med proteiner av intresse. Bildningen av plana SLBs beskrivs, vilka innehåller en-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (POPC) som huvudingrediens (90-99%) och den syntetiska och funktionaliserad lipid 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3 – {[N- (5-amino-1-karboxipentyl) iminodiättiksyra] -succinyl} nickelsalt (DGS NTA-Ni) i låg förekomst (1-10%). POPC uppbär en mättad fettsyra och en enkelomättad fettsyra och bildar lipiddubbelskikt med hög fluiditet även vid RT. DGS NTA-Ni binder med dess huvudgrupp till poly-histidin svansar och fungerar som ankare för poly-histidin-taggade proteiner av val (Figur 1).
"> Viktigt måste mikroskopi hårdvara innefatta ett antal kringutrustning som beskrivs nedan. Med de uppgifter som lämnats och vissa grundläggande kunskaper i optik och laserfysik, bör varje biolog kunna bygga en enda molekyl avbildning setup. Sample excitation bör helst vara utförs på ett inverterat mikroskop i total inre reflektion (TIRF) läge som denna regim minskar falskt ljus och överdriven bakgrund som uppstår annars Cell auto-fluorescens 9. För detta, en särskild TIRF-kapabla mål (se nedan) och laserbelysning behövs. Vissa experiment kräver belysnings gånger inom millisekundintervall och drivs i snabb följd. Om du vill spara brinntid eller för att undvika onödig blekning orsakad av upprepad belysning är det ofta bra att dela det emitterade ljuset i två eller flera spektrala kanaler. Detta gör det möjligt för samtidig avläsning av två eller flera utsläppsprofiler, som kan bli en viktig faktor när conducting experiment med Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Här kan spelas in emissionen efter enstaka exciteringsljuspuls både från FRET-givare och FRET-acceptor (såsom sensibiliserade emission). Kameran ska fånga tillräckligt fotoner med tillräckligt låg bakgrund för att visualisera enstaka fluoroforer under brinntid. Dator program måste vara upp till uppgiften att synkronisera excitation stängning och bildtagning. En omfattande översikt ges nedan och i figur 2:TIRF-kapabla mål: För målbaserad TIRF belysning den numeriska bländaröppningen (NA) i målet måste vara lika med eller större än 1,4 med användning av standardglas (n = 1,515) 9. Förstoring kan variera mellan 60x till 150x. Målet bör vara kromatiskt korrigeras för att möjliggöra konfokalitet när avbildning olika fluoroforer.
Lasrar: Antalet tillgängliga lasrarr optioner har ökat väsentligt under de senaste åren. Moderna elektroniskt modulerbar kontinuerlig våg diodlasrar är kostnadseffektiv och kan drivas med oöverträffad frekvens och hastighet. Dyrare gas jon lasrar utmärka sig i laserstrålen kvalitet, men kräver extern stängning (se nedan) och ofta omfattande (vatten-) kylning.
Exciteringsluckor: Akusto-optiska modulatorer (AOM) tillåter snabb stängning i snabb följd 10. För tät stänga kombinationen av en AOM med mekaniska slutare rekommenderas. På detta sätt omfattande uppvärmning av AOM på grund av kontinuerlig ljusexponering undviks och ljus läcker från AOM i off-läget avbryts ut.
Linser används för att vidga laserstrålar och för att fokusera dem på det bakre fokalplanet av målet. På så sätt lämnar excitationsljuset målet som en parallell stråle (fig 3), som krävs för TIRF belysning avprovet. Moving fokalpunkten inom det bakre fokalplanet från centrum till periferin av målet kommer att ändra vinkeln vid vilken strålen lämnar målet, men inte placeringen av laserpunkten på provet (figur 3), som är en funktion av den totala strålen geometri. TIRF belysning följer vid en kritisk vinkel, som kan justeras med hjälp av en uppsättning av speglar fungerar som ett periskop att översätta brännpunkt lasern inom fokalplan målet. Linser bör kromatiskt korrigeras och kan användas i en uppsättning av två eller tre linser. En tre-linssystemet består av två linser som fungerar som ett teleskop för att vidga laserstrålen (och följaktligen belysnings fläck vid provet) och en tredje lins för att fokusera den breddade strålen i det bakre fokalplanet av målet (Figur 4). Båda funktionerna (teleskop och fokus) kan också uppnås genom en kombination av endast två linser (se Figur 4).
<p class="jove_content"> Speglar bör vara minst 95% reflekterande för att undvika förlust av laserljus. För varje stråle justering en uppsättning av två speglar brukar tillämpas som sådant arrangemang är tillräcklig för att exakt justera valfri vinkel och position för en laserstråle.Dikroiska över reflektera och sända ljus av olika våglängder specificerade och används för att överlagra eller dela balkarna av två lasrar.
Polychroic filter är mer komplicerade än bikromatfilter och behövs för att reflektera inkommande excitationsljus och överföra utgående emissionsljus från provet. De är placerade i filter kuben mellan målet och mikroskopet tublinsen.
Städa upp filter: Beroende på vilken typ av laser employe d laser städa upp filter med en smal överföringsbandbredd ska placeras in i laserstrålen direkt efter det lämnar lasern.
Notchfilterär utformade för att på ett effektivt sätt absorbera laserljus med en smal bandbredd och överföra alla andra ljus. De är placerade i banan utsläpps att filtrera bort alla falska laser excitation ljus. Men notch filter fungerar endast vid 0 ° inkommande vinkel. Om bandbredd av notchfiltret är mycket skarp, kan de olika inkommande vinklar inte återspeglas längre. Blockering av kollimerade laserlaserljus påverkas inte, men återspridda ljuset kanske inte effektivt hindras från att nå kameran.
Motoriserade filterhjul utrustade med lämpliga filter hjul kan lätt placeras i excitation och emissions vägen och tillåta enkel växling mellan olika ljusstyrkor (när den är utrustad med ND-filter) eller fluorescerande kanaler (när den placeras framför en xenon eller kvicksilverbåglampa för ratiometrisk kalcium avbildning eller framför kameran för att välja för den emitterande fluoroforen).
50:50 kub stråldelaren cett användas för att dela laserstrålarna i två separata excitation strålgångar och även att kombinera dem framför periskop.
Stråldelaren (sökväg emission): För snabb bildtagning utan behov av fysiska filterbyte, strålen utsläpps delas upp i en blå-skiftat och rödskiftade kanal. I princip kan stråldelare byggas genom användning av en dikroisk kil eller en uppsättning speglar och en dikroisk spegel för att separera strålen emission i ett våglängdsberoende sätt. Två emissionsfilter behövs för att rensa upp de utsända kanaler.
Rymdfilter: Fysisk filtrering av excitationsstrålen krävs ibland för att avlägsna icke-parallella ljusstrålar emitterade från låg kvalitet laserstrålar. En spatialt filter består av ett två-linsteleskop med ett litet hål placeras exakt vid fokalpunkten för båda linserna. På detta sätt oäkta ljus till följd av icke-parallella delar av laserstrålen blir effektivt blockerat. Such villkor måste uppfyllas vid fastställandet TIRF-baserad mikroskopi. Rymdfiltrering ökar med mindre porer, som är svårare att placera in i brännpunkten, och med mindre brännvidder på den första linsen. För att minska effekter orsakade av linsaberration är det fördelaktigt att använda i stället för enkla linser av hög kvalitet och oändlighet-korrigerade mål mikroskop med låg förstoring (10x eller 20x).
Periskop: ett periskop setup är nödvändigt att översätta den fokuserade laserstrålen i det bakre fokalplanet av målet, en förutsättning för TIRF avbildning. Det kan lätt byggas från två två-tums speglar, en translationssteget för justering av första spegel och ett inlägg för att positionera den andra spegeln för att reflektera den vidgade och fokuserade exciteringsstråle in i mikroskop (fig 5).
Kamera: Back-belysta Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) används rutinmässigt förinspelning av enstaka molekyl signaler. Detta är på grund av deras höga kvantverkningsgrad (upp till 95%), hög upptagningshastighet (upp till 30 MHz) och jämförelsevis lågt brus. Nedkylning till -80 ° C minskar termiskt brus och stöds av ett antal annonser EMCCD kameror. En begränsning av EMCCD tekniken är att kameran brus ökar linjärt med både kameran förstärkningen och signalen tas. Detta är inte fallet med vetenskapliga CMOS (sCMOS) kameror, som är betydligt billigare och driva på grund av den speciella arkitektur sCMOS chip också mycket snabbare än EMCCD kameror. Men ett problem i samband med CMOS-tekniken är att bilden förvärvet fortfarande saknar en viss grad av en kvantitativ avläsning på en enda molekyl nivå, eftersom varje pixel har olika detektionskänslighet. I princip kan detta kompenseras genom bildelementet normalisering, men detta förfarande är inte på något sätt trivial 11. Detta är anledningen till att vi fortfarande tvekar att reberömma sCMOS kameror för enda molekyl mikroskopi, men med tanke på den snabba utvecklingen av denna teknik kan sCMOS kameror snart bli kameran val. Långsam scan CCD-kameror kameror undvika förstärkning relaterade buller och pixel varians alla tillsammans och stödja snabbaste förvärvs priser om de kan användas i en så kallad "kinetiska" -läge. I detta läge är hela kamerachip med undantag för ett område av intresse (ROI) är maskerad, vilket gör det möjligt att använda själva chippet som en lagringsenhet. Efter ROI exponeras för första gången, är de resulterande laddningar skiftas in i maskerade området av chipset pixellinjen för pixel linje, där bilden skyddas från ytterligare ljusexponering. När skiftningen av alla linjer i ROI i den maskerade regionen är avslutad (i sub-millisekund-området), är ROI sig redo för nästa exponering. Denna cykel upprepas tills alla pixellinjer CCD-chipet är laddade. Chipet är sedan läsa ut långsamt med markant reduced avläsning buller. Till exempel på en 1000 x 1300 pixel chip, kan 20 ROI med 50×50 pixel registreras i snabb följd. Eftersom bilderna kvar på chipet under en avsevärd tid innan den utläses, är det viktigt att säkerställa hög kvalitet maskering och att kyla kameran (t.ex. med flytande kväve) som ett sätt att minska överdriven termiskt brus. Vissa EMCCD kameror stöder också den kinetiska läget.
Programvara: Tidpunkt för lasrarna, fönsterluckor, AOMs och kamerans exponering liksom lämplig bildlagring är en integrerad del av en framgångsrik avbildning experiment. I princip många definierade operationer kan programmeras med tillgängliga mjukvarupaket som följer med kameran. Kommersiella mjukvarupaket stödja ett stort antal hårdvara kringutrustning, som kan genomföras med lite tekniska kunnande.
Pulsgenerator, Data Acquisition (DAQ) styrelse (med analoga och digitala utgångskanaler) och oscilloskop: En pulsgenerator är ettutmärkt val för att konvertera triggpulser till pulser med definierad tid och spänning. Detta sätt lasrar kan kontrolleras exakt för uteffekt och tids i millisekund till sub-millisekund sortiment. DAQ kort med analoga utgångar uppnå samma och är lätta att integrera i datorns moderkort via PCI-platser. Pulslängd, amplitud och frekvens verifieras med ett oscilloskop.
Inneslutning av hela excitationsstrålen väg: att undvika svängningar i exciteringsprofilen på grund av luft convections hela exciteringsstrålens väg ska bifogas från sin labbmiljö. Denna åtgärd är särskilt viktigt när de utför TIRF mikroskopi. Optiska komponenter också skyddas från damm och det mänskliga ögat från laserljusexponering. Inhägnader kan enkelt bygga från svart kartong, som kan köpas i konst leverans butiker.
För att bestämma rörligheten på SLB fluorescens återhämtning efter PhotobleacHing (FRAP) mätningar 12 utförs. För FRAP förekomsten av två exciterings strålgångar är lämpligt (se figur 3). Den första strålgången är utformad för att avbilda fluorescensen av dubbelskiktet. Detta kan göras i TIRF konfiguration och med låg ljusintensitet. Den andra strålens väg bör möjliggöra en kort men intensiv blekmedel puls och bör konfigureras i icke-TIRF-läge, så att den lämnar målet längs den optiska axeln. En rund öppning kan placeras i excitationsstrålen vägen (se figur 8) för att projicera en helt rund blekmedel Profilen med definierade kanter. För att avbilda denna öppning på objektplanet, skulle dess optimala läget vara i fokalplanet för linsen 3 (se figur 3). Men på grund av den långa brännvidd denna lins kan också genereras en öppning bild av tillräcklig kvalitet, när öppningen är placerad på något skiftade positioner.
Efter att ha utfört tHan imaging experiment rådata måste analyseras på lämpligt sätt. Flera steg-för-steg-protokoll erbjuds, som täcker justering av huvudinställningarna (t.ex. belysning makt och tid, TIRF vinkel), insamling och analys av data.
Enda molekyl mikroskopi ger en unik möjlighet att studera beteendet hos proteiner i deras nativa cellulära miljö. Molecular imaging blir därför allt mer attraktivt för en bred forskarsamhället, men många liv forskarna fortfarande skygga den initiala investeringen i teknik och expertis. Den största fördelen till följd av montering en egen bildsystem är att det lätt kan anpassas till alla specifika behov.
Som föreslås häri en icke-TIRF excitationsstrålen kan enkelt implementeras förutom en befintlig TIRF ljusstrålen, om en snabb och definierade fotoblekning (eller -activation) av fluoroforer och ligander önskas, till exempel när du utför FRAP eller ligand uncaging experiment 14 . Införandet av en emissions stråldelare möjliggör samtidig inspelning av minst två och i vissa fall upp till fyra fluorescerande kanaler. Listan över tillägg är i huvudsak endast begränsas avens egen fantasi.
Till exempel, genomföra en motordriven emissionsfilterhjul i vägen utsläpps möjliggör snabb växling mellan upp till tio olika fluorescerande kanaler. När man kombinerar två motoriserade utsläpp filterhjul (alla är utrustade med 10 filterplatser) i serie, upp till 18 fluorescerande kanaler kan läsas ut. TIRF-baserad avbildning kan kompletteras med kalcium mobilisering mätningar och Interference Reflection Microscopy (IRM) efter integration av en Xenon eller Mercury excitation lampa väg. IRM är en lämplig metod för att visualisera vilken grad celler är fästa vid glasytan eller en SLB och kan därmed ge viktig information vid tolkningen TIRF-baserade bilddata. Att upprätta en vidgad exciteringsstråle med användning av en enkel dikroisk spegel och en ytterligare laser med 405 nm tillåter ledande fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), dvs två superresolution metoder med en positionsnoggrannhet under diffraktionsgränsen av synligt ljus 15,16.
Men är experimentell framgång inte bara en fråga om lämplig hårdvara. För att dra full nytta av buller reducerade TIRF-baserad avbildning, bör cellerna göra kontakt med en yta på ett sätt som inte införa begränsningar på cellytan eller som stör fysiologi deras plasmamembran. SLBs funktionaliserad med lämpliga proteiner för celladhesion överskrider väl lämpade för detta ändamål eftersom alla SLB-inbäddade ligander är lateralt mobil och justera deras sidoläge inuti dubbelskiktet som svar på receptorbindning och segregations dynamik.
För att tillverka SLBs på ett reproducerbart sätt, är det bäst att starta med SUVs med hög renhet. Såsom beskrivs häri, är det sålunda kritiskt att avlägsna multilamellära vesiklar, som också produceras under sonikering, i två ultracentrifugeringssteg som dessa interfere med bildandet av sammanhängande SLBs featuring hög fluiditet. SLBs av hög kvalitet utgör bara på rena glasytor. När rengöras glas bör användas omedelbart eller förvaras i vakuum. Allt måste SLBs aldrig utsättas för luft, eftersom detta skulle leda till att de störningar. SLB tvätt innebär, såsom visas, buffert sköljning med hjälp av en serologisk pipett, eftersom detta är inte bara rädda, men också tidsbesparande procedur.
Under skörd och rening av SLB-bosatta proteiner bör undvika att använda tvättmedel. Detta beror på att detergenten kommer att minska protein rörlighet avsevärt även då de är närvarande i spårmängder. För att kringgå behovet av rengöringsmedel tillsammans, är löslig uttryckning av utsöndrat polyhistidintagg utrustade ligander rekommenderas i däggdjurs- eller insektsceller. Om återveckning från E. coli inklusionskroppar krävs, måste försiktighet användas för att ta bort tvättmedel effektivt från inklusionskropparna innan de oför och återveckning.
En stor fördel med att använda SLBs resultat från deras modulära och reconstitutive natur, som gör det möjligt att specifikt dissekera rollen av en given receptor-ligand-interaktion för cellaktivering och celladhesion. I detta avseende är det viktigt att nämna att DGS NTA-Ni bör vara närvarande vid 10% inom SLB i syfte att förhindra proteiner konkurrerar om NTA-Ni-bindningsställen. Vid användning av SLBs hyser endast 1% eller 2% DGS NTA-Ni, en minskning i föreningen av en given polyhistidin-märkt proteinarter kan märkas, i synnerhet vid samtidig inkubation ökande mängder av en andra polyhistidin-märkta proteinarter (opublicerad observation). Detta fenomen observeras inte när man arbetar med SLBs presenterar 10% DGS NTA-Ni.
Samtidigt som vi aldrig har sett icke-specifik bindning av någon polyhistidin-märkta proteinet testas för att SLBs innehållande DGS NTA-Ni, bör denna möjlighet testas vid införandet av en protein för första gången,För detta ändamål rekommenderar vi användning av SLBs saknar DGS NTA-Ni (proteinet ska inte binda). För det andra, vid användning av en SLB innehållande DGS NTA-Ni bör proteinet lossna helt efter tvättning av SLB med PBS innehållande 300 mM imidazol.
En annan viktig fördel med att använda SLBs är att transienta interaktioner och signalering händelser kan övervakas med förbättrad Spatiotemporal upplösning 17-19. Detta är åtminstone delvis på grund av en tredimensionell bindande process i huvudsak reduceras till två avbildnings dimensioner, speciellt när du spelar in i buller försvagade TIRF läge. Användningen av SLBs är kompatibel med enda molekyl signaldetektering, en förutsättning för fotoaktiverad lokaliserings mikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM), dvs. Superresolution mikroskopi med en upplösning under diffraktionsgränsen 15,16. Dessa särskilda avbildningsmetoder gör det möjligt enda molekyl Förster Resonance Energy Transfer experiment utformade för att visualisera individuella protein-proteininteraktioner i en synaptisk miljö 20. Detta tillvägagångssätt förklaras i detalj i en JUPITER publikation kallas "Mätning TCR-pMHC bindning med hjälp av en FRET-baserad mikroskopi analys" 21.
Vid tolkning SLB-baserade experiment bör man alltid ha i åtanke att inte alla egenskaper hos ett plasmamembran av en levande cell presenteras av SLBs, och att en del av de saknade kvaliteterna kan påverka fysiologi under utredning. När allt kommer omkring, är SLB-inbäddade proteiner fritt spridande och inte organiserade i membranmikrodomäner som de flesta av deras cellulära motsvarigheter är 5,6,22. Immobiliserad plasma membranark härledda från vidhäftande celler, som bevarar den plasmamembran arkitekturen i levande celler i viss utsträckning, har framgångsrikt används för att studera upptagningen från membraninbäddade antigener genom B-lymfocyter 23. Men även sådanamembran inte interagera med en mycket dynamisk cytoskelettet och har ingen flexibilitet, eftersom de stöds av en stel glasytan. Med tanke på dessa skillnader finns det helt klart ett behov av engineering SLBs, som erbjuder medel för att compartmentalize proteiner i ett definierat sätt och som stöds av ytorna av justerbar flexibilitet eller genom ytor som ändrar sin styvhet som svar på lokalt tillämpade ljuspulser.
The authors have nothing to disclose.
MA fick stöd av ett Schrödinger gemenskap i den österrikiska Science Fund (FWF, J3086-B11) och tackar Max-Planck-Society for ekonomiskt och administrativt stöd. GS stöddes av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS13-030). JH stöddes av Wien Science and Technology Fund (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |