Photothrombosis induite par ischémie focale comme un modèle de lésion médullaire chez la souris

Summary

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Abstract

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca²⁺ signaling using two-photon microscopy.

Introduction

Traumatisme de la moelle épinière (SCI) est un état clinique dévastatrice qui affecte les fonctions sensori-motrices et autonomes de la SC. SCI patients survivants se retrouvent souvent avec une paraplégie débilitante qui affecte considérablement leurs activités et de la qualité de la vie quotidienne ^1. SCI modèles expérimentaux ont été un outil indispensable dans la recherche scientifique pour comprendre la physiopathologie de la SCI et les processus de réparation de neurones associés. Ces modèles ont également été utilisés pour tester l'efficacité préclinique de diverses interventions neuroprotectrices expérimentales qui visent à la récupération fonctionnelle. Actuellement, la majorité des modèles SCI dans la pratique emploient l'utilisation de la force physique brutale de perturber mécaniquement et blesser le SC. Ces méthodes comprennent contusion, compression, la dislocation et transection du SC ^2. Il a été suggéré que, après l'insulte mécanique primaire une lésion secondaire sous la forme d'ensembles d'ischémie dans la SC blessé 3,4. L'étiologie de l'ischémie secondaire comprend une vaste dégénérescence des tissus, l'hémorragie parenchymateuse et parfois par l'obstruction des vaisseaux sanguins par un œdème des tissus ^5-7. À la suite de la lésion secondaire l'intégrité de SC est en outre affectée, les neurones et les cellules gliales sont gravement altérées dans la fonction et la viabilité et l'apoptose qui conduit à l'infarctus croissance au cours de la phase chronique de la blessure, analogue à la croissance de pénombre ischémique suite d'un AVC ^8,9. Plusieurs mécanismes comme excitotoxicité, production de radicaux libres, et l'inflammation ont été signalés à être responsable de la mort cellulaire ischémique suivant SCI ^10,11. En outre, SC ischémie est une complication grave de l'anévrisme aortique thoraco-abdominaux chirurgies de réparation qui conduisent souvent à la paraplégie chez les patients ^12,13. En dépit de cet impact clinique haute très peu de modèles de ischémie de la moelle épinière avec une reproductibilité élevée sont actuellement disponibles.

nt "> Photothrombosis (PT) est une méthode couramment utilisée pour l'induction d'une ischémie focale dans le cerveau ^14-20. La technique est assez non-invasif, hautement reproductible et produit une lésion ischémique focal précis dans la zone exposée du cerveau ^{17 -21.} Ceci est réalisé par administration systémique de colorants photoactifs tels que le rose Bengale (RB) ^16-20,22 érythrosine B ou ²³ suivie par une irradiation localisée de vaisseaux sanguins avec une source de lumière appropriée. photoactivation du colorant provoque la génération de radicaux libres qui perturber l'intégrité de l'endothélium vasculaire lisse, et provoquent les plaquettes d'accumuler, qui forme ensuite un thrombus. L'obstruction de la circulation sanguine par les résultats de thrombus dans un infarctus dans la région fournies par le navire ^24. En raison de la facilité de contrôle de la l'intensité et la durée de l'irradiation de cette procédure donne un infarctus très uniforme et reproductible. En outre, ce procédé peut être utilisé pour induire un infarctust à divers emplacements anatomiques permettant spatiale (par exemple, la matière grise vs. matière blanche) compréhension de l'effet de l'ischémie.

L'objectif de la présente étude est de développer un modèle facile et hautement reproductible de SC ischémie chez les souris. Nous avons décrit la procédure d'un modèle d'ischémie PT de SC chez des souris. Les résultats de l'histologie et immunomarquage ont démontré que PT peut induire efficacement SC du myocarde, une perte neuronale et une gliose réactive.

Protocol

Note: Des souris (C57BL / 6J, mâle) ans 10-12 semaines fussent utilisés dans cette étude. Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par l'Université du Missouri institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC). 1. Pré-chirurgie La veille de l'intervention autoclave et stériliser tous les instruments chirurgic…

Representative Results

Le but de cette étude était de produire ischémie de la moelle épinière chez des souris en utilisant un modèle de PT. Après la région désirée de l'os au-dessus de la moelle épinière (T10 – T12) a été amincie, Rose Bengale a été injecté à travers le sinus rétro-orbital itinéraire, et l'ischémie a été induite par PT Figure 1A, B correspond à la souris placée dans un instrument chirurgical sur mesure. plate-forme au cours de la chirurgie. La souris a été maintenu en place …

Discussion

Dans cette étude, nous avons décrit un modèle de photothrombotique SC ischémie. Grâce aux progrès en génie génétique, il ya eu une forte augmentation des souris transgéniques disponible dans le commerce qui a permis d'étudier l'impact des gènes spécifiques impliqués dans la physiopathologie ischémique dans la SC. Le but de l'étude était de développer un modèle de souris reproductible de ischémie de la moelle épinière. Ici nous avons adapté un modèle PT corticale pour …

Materials

Rose Bengal	Sigma-Aldrich	330000	20 mg/ml in sterile saline
C57Bl6/J	Jackson lab	664	22-25g
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/ml
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	100 mg/ml
Betadine solution	Purdue	NDC-67618-150-01	10% povidone iodine topical solution
Normal saline	Abott Laboratories	04930-04-10	For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying
Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Ethanol	Decon labs.Inc	2716	70% ethanol for disinfection
Metal halide lamp	EXFO, Canada	X-Cite 120 PC	Set power at 12%
Spring scissors	Fine Science Tool	15000-10	for minor dissection
Scissors (angled to side)	Fine Science Tool	14063-011	No. 3 handle
Standard scalpel	Fine Science Tool	10003-12	for removing muscle
Scalpel blade	Feather	2976	No. 10
Forceps (curved)	Fine Science Tool	11150-10	for holding tissue
Forceps (straight)	Fine Science Tool	11151-10	for holding tissue
Needle holder	Fine Science Tool	12002-12	for suturing
Tissue adhesive glue	3M Vetbond	1469SB	to adhere to edges of the cut skin
Monofilament polypropylene	USSC Sutures	VP-521	Size = 4-0 (for fascia)
Perma-hand silk	Ethicon	683G	Size = 4-0 (for skin)
Micro drill	Roboz Surgical Instrument Co. Inc.	RS-6300	with bone polishing drill bit
Laser doppler flowmeter	Moor Instruments	moorVMS-LDF1	for monitoring change in blood flow
Heating pad	Fine Science Tool	21052-00	to prevent hypothermia
Lab-Jack	Fisher scientific	14-673-50	4×4 in plate to adjust the height of the animal
X-Y gliding stage	Amscope	GT100	for positioning the animal under microscope