Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.
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Artigo de método
Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca
Neste artigo
Resumo
Resumo
O manuseio do retículo sarcoplasmático (SR) de Ca2+ desempenha um papel fundamental no acoplamento normal de excitação-contração e o manuseio aberrante de SR Ca2+ é conhecido por desempenhar um papel significativo em certos tipos de arritmia. Como as arritmias são fenômenos emergentes espacialmente distintos, elas devem ser investigadas no nível do tecido. No entanto, os métodos para sondar diretamente o SR Ca2+ no coração intacto permanecem limitados. Este artigo descreve o protocolo para mapeamento óptico duplo do potencial transmembrana (Vm) e intra-SR livre [Ca2+] ([Ca2+]SR) no coração de coelho perfundido por Langendorff. Essa abordagem aproveita o indicador de baixa afinidade Ca2+ Fluo-5N, que tem fluorescência mínima no citosol, onde o [Ca2+] intracelular ([Ca2+]i) é relativamente baixo, mas exibe fluorescência significativa no lúmen SR, onde [Ca2+]SR está na faixa milimolar. Além de revelar características SR Ca2+ espacialmente em toda a superfície epicárdica do coração, essa abordagem tem a vantagem distinta de monitorar simultaneamente Vm, permitindo investigações sobre a relação bidirecional entre Vm e SR Ca2+ e o papel de SR Ca2+ em fenômenos arritmogênicos.
Introdução
O mapeamento óptico duplo de Ca2+ intracelular e potencial transmembrana (Vm) no coração perfundido por Langendorff intacto tornou-se um dos pilares das investigações em eletrofisiologia cardíaca, incluindo mecanismos de arritmia e acoplamento excitação-contração1-4. Essa abordagem forneceu conhecimento sem precedentes sobre eletrofisiologia normal e anormal e, mais importante, sobre a relação bidirecional entre Vm e Ca2+ intracelular. No entanto, o mapeamento óptico de Ca2+ intracelular com indicadores fluorescentes de alta afinidade (como Rhod-2 e Fluo-4) relata apenas alterações em massa no Ca2+....
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Protocolo
Todos os procedimentos que envolvem animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade da Califórnia, Davis Animal, e aderiu ao Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo National Institutes of Health.
1. Preparação
- Prepare dois concentrados (25X) As provisões de solução modificada de Tyrode com antecedência e armazenar a 4 ° C: (1) Stock I (em mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26.25) e (2) Stock II (em mM: NaHCO 3 500).
- Recentemente preparar a solução de 2 L de Tyrode com a seguinte composição (em mM): N....
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Resultados
A Figura 1A mostra um diagrama esquemático da configuração óptica para dual V m e SR Ca2 + mapeamento. Com esta configuração, não há separação espectral completa do V m e SR sinais de Ca2 + (Figura 1B). Um diagrama do sistema de perfusão de circuito duplo usado para Fluo-5N corante de carga está ilustrado na Figura 1C. A Figura 1D mostra a orientação horizontal do coração no prato de perfusão. Representante V .......
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Discussão
As chaves para o sucesso de Fluo-5N corante de carga são o pequeno volume de configuração de recirculação de perfusão, que permite uma elevada concentração de Fluo-5N sem a necessidade de grandes quantidades de corante, o período de tempo de carregamento (1 hr), e executar o carregamento à TA. Se o carregamento é realizado a temperaturas fisiológicas, actividade enzimática celular cliva rapidamente o tag -AM quando o corante atravessa a membrana da célula, prendendo as moléculas de corante no citosol e não permitindo-lh.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01 HL 111600) e pela American Heart Association (12SDG9010015).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Componente da solução de Tyrode |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Componente da solução de Tyrode |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Componente da solução de Tyrode |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Componente da solução de Tyrode |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Componente da solução de Tyrode |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Componente da solução de Tyrode |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Componente da solução de Tyrode |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | Para oxigenação e pH da solução de Tyrode |
| Blebbitatina | Tocris Bioscience | 1760 | Desacoplador de excitação-contração |
| RH237 | Biotium | 61018 | Corante sensível à voltagem |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Indicador Ca2+ de baixa afinidade; Alternativa: Invitrogen F-14204; O carregamento deve ser realizado à temperatura ambiente |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | Para carregamento do indicador Ca2+; Aquecer até que a solução esteja límpida antes de utilizar |
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Para dissolver a blebistatina e os corantes |
| Filtrar | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μ m filtro em linha |
| Transdutor de Pressão | WPI | BLPR2 | Para medir a pressão de perfusão |
| Transbridge Transdutor Amplificador | WPI | SYS-TBM4M | Para transdução/amplificação de sinal de pressão; O PowerLab também pode ser usado com instrumentos apropriados do BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | Para gravação contínua de sinais de pressão e ECG | |
| THT Macrscope | SciMedia | Configuração óptica macroscópica. Detalhes: objetiva de 0,63X (NA = 0,31), objetiva de condensação de 2X, campo de visão resultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profundidade de foco = ~ 1,5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Câmeras de mapeamento óptico | |
| de foco LED de precisão | Mightex | PLS-0470-030-15-S | Fonte de luz LED |
Referências
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, ....
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Reimpressões e permissões
