Lunge Tumor celle rekruttering Assay

Summary

Dette manuskript beskriver en metode til at kvantificere tumor celle ophobning i lungerne i en dyremodel af tumor metastaser.

Abstract

For at undersøge de molekylære mekanismer for tumor metastaser, er blevet foreslået forskellige assays ved hjælp af musen som en model dyr. Her viser vi en simpel analyse for at vurdere tumor celle ekstravasation eller micrometastasis. I denne analyse, tumorceller blev injiceret gennem halen vene, og efter en kort periode, lungerne blev dissekeret og fordøjet for at tælle de akkumulerede mærket tumorceller. Denne analyse springer det første trin af primær tumor invasion ind i blodkar og letter undersøgelsen af begivenhederne i fjernt organ hvor tumor metastaser opstår. Antallet af celler injiceres ind i blodkar kan optimeres for at observere et begrænset antal metastaser. Det er blevet rapporteret, at stromale celler i Fjern organ bidrage til metastaser. Således, denne analyse kunne være et nyttigt redskab til at udforske potentielle terapeutiske lægemidler eller anordninger til forebyggelse af tumor metastaser.

Introduction

Tumor metastaser konti for høj dødelighed i cancer-relaterede sygdomme. Fra synspunkt af undersøgelser på det molekylære niveau, metastaser kan opdeles i flere trin: tumor indledningen på den primære tumor site, primær tumorvækst og invasion i omkringliggende væv, intravasation, omsætning gennem blodkarrene , ekstravasation på fjerntliggende organer, og tumor re-vækst. Hvert trin indebærer forskellige sæt af molekyler/signaler¹.

Undersøgelser til dato har drejet sig om hændelser, som forekommer i fjerntliggende organer før tumorcellerne, cirkulerer i blodet, hvilket er også kendt som den præ metastatisk fase^{2,3,4,5, 6}. Vores mus model undersøgelser afslørede, at fasen forud metastatisk letter lunge metastaser ved at skabe langvarig og low-level inflammatoriske respons i lungerne. Den pre-metastatisk fase er kendetegnet ved hyperpermeability af themicrovasculature, rekruttering af knoglemarven afledt celler (BMDC) og opregulering af cytokin/chemokine-lignende molekyler herunder S100A8 og SAA3^3,4 . Det er blevet rapporteret, at lysyl oxidase ændrer den ekstracellulære matrix i lungerne til at rekruttere BMDCs⁷. En anden betænkning har afsløret betydningen af Angpt2, MMP3 og MMP10 i pre metastatisk fase⁸. Med andre ord, det indviklede samspil mellem primære tumorer, knoglemarv og fjerntliggende organer skal være forstået og korrekt moduleret (for eksempel ved hjælp af narkotika, der er målrettet proteiner involveret i disse interaktioner) at forhindre fremtidige metastase⁹ . For at regulere den pre metastatisk fase, bør det først visualiseret og evalueres for diagnostiske eller terapeutiske indgreb. Her rapporterer vi en lunge tumor celle rekruttering assay, der giver mulighed for undersøgelse af pre metastatisk fase i lungerne.

Tumorceller direkte sprøjtet ind i blodkar af musen er lig cirkulerende tumorceller i kræftpatienter, selv om der kan være forskelle mellem kulturperler celler og cirkulerende tumorceller. Cirkulerende tumorceller undergå sig nogle karakteristiske ændringer, når de indtaster omsætning fra den primære tumor. Ikke desto mindre kan kulturperler celler danne tumorer hos immundefekte mus når de er indsprøjtet i halen vene. Derudover i mus modelsystem, kan fluorescens mærket tumorceller bruges som tillader sporing af disse celler i kroppen. Opførsel af cirkulerende tumorceller er kritisk, da de afgør de endelige konsekvenser i kræft patienter¹⁰. Blod er ikke et godt sted for overlevelse af tumor celler². De har brug at flygte fra angreb af immunsystemet vært og behovet for anti-apoptotiske signaler at forhindre apoptose mangel af fysisk støtte. Tumorceller med højere evner af tumor indledning på metastatisk sites generere flere tumor knuder. Hvis tumorceller vise specifikke orgel tropisme, bemærkes metastaser i disse særlige organer. De første trin af den metastatisk kaskade (primær tumorvækst og invasion) er ikke inkluderet i denne analyse, og så fokus er på samspillet mellem cirkulerende tumorceller og stromale celler (endotelceller, epitelceller og blodlegemer). I konventionelle tumor celle indsprøjtning assays har forskere til at vente indtil tumor knuder vokser til en konkret størrelse at påvise metastaser. I dette tilfælde ikke kan det nøjagtige antal tumorceller i blodkar kvantificeres. Denne proces indeholder desuden en tumor genvækst fase, der angiver, at andre faktorer i tumorcellerne kan påvirke resultatet.

Tælle er mærket tumorceller under et fluorescens stereomikroskop en enkel proces. Stereomikroskopet giver et bredt synsfelt, så hele lungen kan scannes. Flowcytometri er også et nyttigt værktøj, der straks giver en præcis antal tumorceller i vævet. Tælle fluorescerende celler i vævet under en Konfokal mikroskop er også muligt og viser de mest præcise billeder af metastatisk tumorceller, men det er tidskrævende og kan give partisk resultater, hvis kun et markeret område er optalt. Det ultimative mål for denne analyse er at observere, hvordan let tumorceller ophobes i lungerne. Som rapporteret tidligere^3,4, hvis lungerne er i pre metastatisk fase på grund af inflammatorisk signalering fra den primære tumor, er injiceres tumorcellerne tilbøjelige til at ophobe sig i lungerne, hvilket således indebærer større chancer for lunge metastaser. Andre betingelser (leddegigt, astma, etc.), og deres behandling med anti-inflammatoriske lægemidler (såsom anti-TNFα) kan dæmpe lunge metastaser. Dermed, vi konkludere, at denne analyse er et kraftfuldt værktøj til at vurdere muligheden for lunge metastaser.

Protocol

Alle procedurer udføres med mus blev godkendt af Animal forskning Udvalget af Tokyo Women’s Medical University. 1. hale vene injektion af Lewis lunge karcinom (LLC) celler Vedligeholde LLC celler i DMEM suppleret med 10% FCS, i en fugtig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Celler bør indeholde en fluorescerende proteiner udtryk system (f.eks. normal god landbrugspraksis). Fjerne celler fra kultur parabol ved hjælp af en ikke-enzymatiske celle dissociation r…

Representative Results

Lungerne præsentere mange normal god landbrugspraksis-LLC celler 2 h efter injektion (figur 1A). Det skal bemærkes, at de fluorescerende steder også opdaget i den røde filter bør udelukkes fra nummer celletal. Langt størstedelen af LLC celler forsvinder fra lungerne 24 timer efter injektion (figur 1 c). For at bekræfte antallet af normal god landbrugspraksis-LLC …

Discussion

Forbehandling af mus med antistoffer, narkotika, højt fedtindhold kost eller tumor-aircondition medium før tumor celle indsprøjtning er muligt. Det sværeste skridt i denne analyse er hale vene injektion. Ufuldstændig injektion resulterer i uafklarede data. Hale vene i C57BL/6 er særligt vanskeligt at identificere, hvilket resulterer i fejlbehæftede injektioner. Placere mus på en varmepude (37 ° C) spile hjælper hale vene, således at injektionen bliver lettere.

Denne analyse bruger e…

Materials

Collagenase	Sigma	C6885
Dispase	Gibco	17105-041
Bovine serum albumin	Sigma	A7030
DPBS	Gibco	14190-144	no calcium, no magnesium
Deoxyribonuclease I	Sigma	DN-25	trace amount
RBC lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer	BD	352340	40 micrometer mesh
Fluorescence labeling kit	Sigma	MIN26-KIT
DMEM	Gibco	11965-092
0.22 μm syringe filter	sartorius	17597K
O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145