Dit manuscript beschrijft een methode om te kwantificeren tumor cel accumulatie in de longen in een diermodel van uitzaaiing van de tumor.
Voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen bestuur tumor metastase, verschillende testen met behulp van de muis als een dier model voorgesteld. Hier tonen we een eenvoudige test om te evalueren van de tumor cel extravasation of micrometastasis. In deze test, tumorcellen waren geïnjecteerd door de ader van de staart, en na een korte periode, de longen werden ontleed en verteerd om te tellen de geaccumuleerde gelabelde tumorcellen. Deze test wordt overgeslagen de eerste stap van primaire tumor invasie in het bloedvat en vergemakkelijkt de studie van gebeurtenissen in het verre orgaan waar de uitzaaiing van de tumor zich voordoet. Het aantal cellen in het bloedvat geïnjecteerd kan worden geoptimaliseerd om te zien hoe een beperkt aantal metastasen. Er werd gemeld dat stromale cellen in het verre orgel aan metastase bijdragen. Dus zou deze test een nuttig instrument om te verkennen potentiële therapeutische drugs of apparaten voor preventie van uitzaaiing van de tumor.
Tumor metastase rekeningen voor de hoge sterfte in kanker-gerelateerde ziekten. Vanuit het oogpunt van onderzoek op moleculair niveau, metastase kan worden onderverdeeld in meerdere stappen: tumor inleiding op de primaire tumor site, de groei van de primaire tumor en de invasie in de omringende weefsels, intravasation, omloop door de bloedvaten , extravasation op verre organen en tumor uitgroei. Elke stap impliceert verschillende soorten moleculen/signalen1.
Studies tot op heden zijn bezorgd met gebeurtenissen die plaatsvinden in verre organen voordat de tumorcellen circuleren in het bloed, die ook bekend staat als de pre metastatische fase2,3,4,5, 6. Onze muis model studies is gebleken dat de vooraf metastatische fase Long metastase vergemakkelijkt door het creëren van duurzame en low-level inflammatoire reacties in de longen. De vooraf metastatische fase wordt gekenmerkt door hyperpermeability van themicrovasculature, werving van afgeleid beenmergcellen (BMDC), en opregulatie van cytokine/chemokine-achtige moleculen met inbegrip van S100A8 en SAA33,4 . Er werd gemeld dat lysyl-oxidase wijzigt de extracellulaire matrix in de longen te werven BMDCs7. Een ander rapport is gebleken dat het belang van Angpt2, MMP3 en MMP10 in de vooraf metastatische fase8. Met andere woorden, de complexe interacties tussen primaire tumoren, beenmerg en externe organen moeten worden begrepen en correct gemoduleerd (bijvoorbeeld door het gebruik van drugs die gericht zijn op eiwitten die betrokken zijn in deze interacties) om te voorkomen dat toekomstige metastase9 . Voor het regelen van de vooraf metastatische fase, moet eerst worden gevisualiseerd en voor diagnostische of therapeutische interventies geëvalueerd. Wij rapporteren hier, een Long tumor cel aanwerving assay waarmee de studie van de vooraf metastatische fase in de longen.
Tumorcellen direct geïnjecteerd in het bloedvat van de muis zijn vergelijkbaar met de circulerende tumorcellen bij kankerpatiënten, hoewel er verschillen tussen gekweekte cellen zijn kunnen en circulerende tumorcellen. Circulerende tumorcellen ondergaan zich enkele karakteristieke wijzigingen bij het invoeren van verkeer van de primaire tumor. Gekweekte cellen vormen echter kunnen tumoren in immunodeficiëntie muizen wanneer ze worden geïnjecteerd in de ader van de staart. Daarnaast, in de muis modelsysteem, kan fluorescentie label tumorcellen worden gebruikt waarmee het volgen van deze cellen in het lichaam. Het gedrag van de circulerende tumorcellen is cruciaal omdat zij de uiteindelijke gevolgen van kanker patiënten10 bepalen. Bloed is niet een goede plek om te overleven van tumor cellen2. Ze moeten ontsnappen uit de aanval door het immuunsysteem van de gastheer en anti-apoptotic signalen om te voorkomen dat apoptosis als gevolg van een gebrek aan fysieke ondersteuning. Tumorcellen met hogere capaciteiten van tumor inleiding op metastatische sites genereren meer tumor knobbeltjes. Als de tumorcellen Toon specifieke orgel tropisme, moet metastase in die specifieke organen worden geobserveerd. De eerste stappen van de metastatische cascade (primaire tumorgroei en invasie) zijn niet inbegrepen in deze test, en zo de nadruk ligt op de interactie tussen het circulerende tumorcellen en de stromale cellen (endotheliale cellen, epitheliaale cellen en bloedcellen). In conventionele tumor cel injectie testen moeten onderzoekers wachten tot de tumor knobbeltjes groeien tot een tastbare grootte detecteren de metastase. In dit geval worden niet het exacte aantal tumorcellen in het bloedvat gekwantificeerd. Dit proces omvat bovendien een tumor hergroei fase, die aangeeft dat andere factoren in de tumorcellen van invloed kunnen zijn op het resultaat.
Tellen is met het label tumorcellen onder een fluorescentie stereomicroscoop een eenvoudig proces. De stereomicroscoop biedt een breed gezichtsveld zodat de hele Long kan worden gescand. Stroom cytometry is ook een nuttig hulpmiddel dat direct een nauwkeurige aantal tumorcellen in het weefsel geeft. Fluorescerende cellen in het weefsel onder een confocal microscoop tellen is ook mogelijk en geeft de meest nauwkeurige beelden van metastatische tumorcellen, maar het is tijdrovend en vooringenomen resultaten kan geven als alleen een geselecteerd gebied wordt geteld. Het uiteindelijke doel van deze test is om te observeren hoe gemakkelijk tumorcellen zich ophopen in de longen. Zoals gemeld eerder3,4, als de longen zijn in vooraf metastatische fase als gevolg van inflammatoire signalering van de primaire tumor, zijn de geïnjecteerde tumorcellen gevoelig voor zich ophopen in de longen, dus impliceert hogere kans op longkanker metastase. Andere aandoeningen (reumatoïde artritis, astma, enz.), en hun behandeling met anti-inflammatoire stoffen (zoals anti-TNFα) kan verzachten Long metastase. Dus, we concluderen dat deze bepaling een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van de mogelijkheid van longkanker metastase.
Voorbehandeling van muizen met antilichamen, drugs, een vetrijke dieet of tumor-geconditioneerd medium vóór tumor cel injectie is mogelijk. De moeilijkste stap in deze test is de staart veneuze injectie. Onvolledige injectie leidt tot twijfelachtige gegevens. De ader van de staart in C57BL/6 is bijzonder moeilijk te identificeren, wat resulteert in mislukte injecties. Plaatsen van de muizen op een verwarming pad (37 ° C) verwijden helpt de staart ader zodat injectie gemakkelijker wordt.
Dez…
The authors have nothing to disclose.
Geen
Collagenase | Sigma | C6885 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |