Analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire
Summary
Cet article décrit une méthode pour quantifier l’accumulation de cellules de tumeur dans les poumons dans un modèle animal de métastases tumorales.
Abstract
Afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent les métastases tumorales, divers essais à l’aide de la souris comme animal modèle ont été proposées. Nous démontrons ici, un simple test pour évaluer l’extravasation de cellules tumorales ou micrométastase. Dans ce test, les cellules tumorales ont été injectées dans la veine de la queue, et après une courte période, les poumons ont été disséqués et digérés pour compter les cellules tumorales marquées accumulés. Ce dosage saute l’étape initiale de l’invasion de la tumeur primitive dans le vaisseau sanguin et facilite l’étude des événements dans l’organe lointain où se produit la métastase tumorale. Le nombre de cellules injectées dans le vaisseau sanguin peut être optimisé afin d’observer un nombre limité de métastases. Il a été signalé que les cellules du stroma dans des organes éloignés contribuent à métastases. Ainsi, cet essai pourrait être un outil utile pour étudier les éventuels médicaments ou dispositifs pour la prévention des métastases tumorales.
Introduction
Métastase tumorale représente une mortalité élevée dans les maladies liées au cancer. Du point de vue des enquêtes au niveau moléculaire, les métastases peuvent être divisés en plusieurs étapes : initiation tumorale sur le site de la tumeur primitive, la croissance de la tumeur primitive et l’invasion en entourant les tissus, intravasation, circulation dans les vaisseaux sanguins , l’extravasation à des organes éloignés et re-croissance de la tumeur. Chaque étape consiste à différents ensembles de molécules/signaux1.
Études à ce jour ont porté sur les événements qui se produisent dans des organes éloignés avant de commencent aux cellules tumorales circulant dans le sang, qui est également connu comme le stade métastatique pre2,3,4,5, 6. Nos études de modèle de souris ont révélé que la phase pré métastatique facilite les métastases pulmonaires en créant des réactions inflammatoires à basse altitude et de longue durée dans les poumons. La phase pré métastatique est caractérisée par l’hyperperméabilité de themicrovasculature, le recrutement des cellules de moelle osseuse provenant (BMDC) et une augmentation des cytokines/chemokine-comme des molécules dont S100A8 et SAA33,4 . Il a été signalé que lysyl oxydase modifie la matrice extracellulaire dans les poumons pour recruter BMDCs7. Un autre rapport a révélé l’importance de la Angpt2, MMP3 et MMP10 dans la phase pré métastatique8. En d’autres termes, les interactions complexes entre les tumeurs primaires, la moelle osseuse et des organes distants doivent être compris et correctement modulée (par exemple, à l’aide de médicaments qui ciblent les protéines impliquées dans ces interactions) pour prévenir les métastases9 . Pour régler la phase pré métastatique, il abord convient visualisé et une évaluation des interventions diagnostiques ou thérapeutiques. Nous rapportons ici une analyse de recrutement de cellules de tumeur pulmonaire qui permet l’étude de la phase pré métastatique dans les poumons.
Les cellules tumorales injectées directement dans le vaisseau sanguin de la souris sont similaires à circulant les cellules tumorales de patients atteints de cancer, bien qu’il peut y avoir des différences entre les cellules et les cellules tumorales circulantes. Cellules tumorales circulantes eux-mêmes subissent certains changements caractéristiques lorsqu’ils entrent dans la circulation de la tumeur primaire. Néanmoins, les cellules cultivées peuvent former des tumeurs chez des souris immunodéficientes lorsqu’ils sont injectés dans la veine caudale. En outre, dans le système de modèle de souris, fluorescence étiqueté cellules tumorales peut être utilisé qui permettent le suivi de ces cellules dans le corps. Le comportement des cellules tumorales circulantes est critique car ils déterminent les conséquences ultimes du cancer patients10. Sang n’est pas un bon endroit pour la survie des cellules de tumeur2. Ils doivent échapper à l’attaque par le système immunitaire et ont besoin de signaux anti-apoptotiques pour empêcher l’apoptosis en raison du manque de support physique. Des cellules tumorales avec des capacités plus élevées d’initiation tumorale métastatique sites génèrent plusieurs nodules de tumeur. Si les cellules tumorales montrent tropisme d’organe spécifique, métastase doit être observée dans ces organes particuliers. Dans ce test, les premières étapes de la cascade métastatique (croissance de la tumeur primitive et invasion) ne sont pas inclus, et si l’accent est mis sur l’interaction entre la circulation de cellules tumorales et les cellules du stroma (cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules du sang). Dans des essais d’injection de cellules de tumeur classiques, les chercheurs doivent attendre que les nodules de tumeur atteignent une taille tangible pour détecter les métastases. Dans ce cas, le nombre exact de cellules tumorales dans les vaisseaux sanguins ne peut être quantifié. En outre, ce processus comporte une phase de repousse de tumeur, ce qui indique que les autres facteurs dans les cellules tumorales peuvent affecter le résultat.
Comptage étiqueté sous un stéréomicroscope de fluorescence des cellules tumorales est un processus simple. Le stéréomicroscope offre un large champ de vision afin que le poumon entier peut être scanné. Cytométrie en flux est également un outil utile qui donne instantanément un nombre précis de cellules tumorales dans les tissus. Compter les cellules fluorescentes dans les tissus sous un microscope confocal est également possible et affiche les photos plus précises des cellules de tumeur métastatique, mais il prend du temps et peut donner des résultats biaisés si seulement une zone sélectionnée est comptabilisée. Le but ultime de ce test est d’observer avec quelle facilité les cellules tumorales s’accumuler dans les poumons. Comme indiqué précédemment,3,4, si les poumons sont en phase métastatique préalable en raison de la signalisation inflammatoires de la tumeur primaire, les cellules tumorales injectées ont tendance à s’accumuler dans les poumons, ce qui implique des chances plus élevées de métastases pulmonaires. Autres conditions (polyarthrite rhumatoïde, l’asthme, etc.) et leur traitement avec des agents anti-inflammatoires (par exemple les anti-TNFα) peuvent atténuer les métastases pulmonaires. Par conséquent, nous concluons que ce test est un outil puissant pour évaluer la possibilité de métastases pulmonaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prétraitement des souris avec des anticorps, de drogues, une alimentation riche en graisses ou milieu conditionné par tumeur avant l’injection de cellules tumorales est possible. L’étape la plus difficile dans cet essai est l’injection dans la veine queue. Injection incomplète se traduit par des données non concluantes. La veine caudale C57BL/6 est particulièrement difficile à identifier, résultant en des injections a échoué. Placer les souris sur un coussin chauffant (37 ° C) aide à dilate la veine cau…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun
Materials
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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