Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay
Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.
Abstract
Um die molekularen Mechanismen Tumor Metastasen zu untersuchen, wurden verschiedene Tests mit der Maus als Modell Tier vorgeschlagen. Hier zeigen wir eine einfache Assays Tumor Zelle Extravasation oder Micrometastasis zu bewerten. In diesem Test Tumorzellen durch die Rute Vene injiziert wurden, und nach kurzer Zeit die Lunge wurden seziert und verdaut die angesammelten beschrifteten Tumorzellen zu zählen. Dieser Assay überspringt den ersten Schritt der primäre Tumorinvasion in das Blutgefäß und erleichtert die Untersuchung der Ereignisse in der entfernten Organ wo Tumor Metastasen auftreten. Die Anzahl der Zellen in das Blutgefäß injiziert kann optimiert werden, um eine begrenzte Anzahl von Metastasen zu beobachten. Es wurde berichtet, dass Stromazellen Zellen in den entfernten Organ zur Metastasierung beitragen. So könnte dieser Assay ein nützliches Werkzeug, um mögliche therapeutische Medikamente oder Geräte für die Prävention von Tumor Metastasen zu erkunden.
Introduction
Tumor Metastasen entfallen hohe Mortalität bei Krebs-Erkrankungen. Aus der Sicht der Untersuchungen auf molekularer Ebene, kann Metastasen in mehrere Schritte unterteilt werden: Tumorentstehung am Standort der Primärtumor, Primärtumor Wachstum und Invasion in das umgebende Gewebe, Intravasation, Zirkulation durch die Blutgefäße , Extravasation auf entfernte Organe und Tumor nachwachsen. Jeder Schritt umfasst unterschiedliche Moleküle/Signale1.
Bisherigen Studien haben besorgt, mit der Ereignisse, die in entfernten Organen vor die Tumorzellen im Blut, die auch bekannt als die bereits metastasierendem Phase2,3,4,5, 6. Unsere Maus Modellstudien gezeigt, dass die bereits metastasierendem Phase Lungenkrebs Metastasen erleichtert durch lang andauernde und Low-Level-Entzündungsreaktionen in der Lunge zu schaffen. Die bereits metastasierendem Phase zeichnet sich durch Hyperpermeability von Themicrovasculature, Rekrutierung von abgeleitet Knochenmarkzellen (BMDC) und Hochregulation der Zytokin/Chemokin-ähnliche Moleküle, einschließlich S100A8 und SAA33,4 . Es wurde berichtet, dass die Lysyl-Oxidase modifiziert die extrazelluläre Matrix in der Lunge, BMDCs7zu rekrutieren. Ein weiterer Bericht hat die Bedeutung von Angpt2, MMP3 und MMP10 in der Pre-metastasiertem Phase8ergeben. Das heißt, die komplizierten Wechselwirkungen zwischen Primärtumoren, dem Knochenmark und entfernte Organe müssen verstanden und richtig (z. B. durch Drogen, die auf Proteinen, die in diesen Interaktionen) moduliert werden um zu verhindern, dass künftige Metastasen9 . Um die bereits metastasierendem Phase zu regulieren, sollte es zunächst visualisiert und ausgewertet für diagnostische oder therapeutische Interventionen. Hier berichten wir über eine Lunge Tumor Zelle Rekrutierung Assay, der die Studie bereits metastasierendem Phase in der Lunge ermöglicht.
Zirkulierende Tumorzellen bei Krebspatienten, obwohl es möglicherweise Unterschiede zwischen kultivierten Zellen und zirkulierenden Tumorzellen ähneln Tumorzellen direkt in das Blutgefäß der Maus injiziert. Zirkulierenden Tumorzellen unterziehen sich einige charakteristischen Veränderungen, wenn sie aus dem primären Tumor in Umlauf. Dennoch können kultivierte Zellen Tumore in immungeschwächte Mäuse bilden, wenn sie in die Rute Vene injiziert werden. Darüber hinaus kann im Maus-Modell-System Fluoreszenz beschriftet Tumorzellen verwendet werden, die Verfolgung dieser Zellen im Körper zu ermöglichen. Das Verhalten der zirkulierenden Tumorzellen ist wichtig, da sie die letzten Konsequenzen in Krebs Patienten10bestimmen. Blut ist kein guter Ort für das Überleben von Tumor-Zellen-2. Sie müssen vor Angriffen durch das Immunsystem des Wirts zu entkommen und brauchen Anti-Apoptotic Signale Apoptose aufgrund mangelnder körperlicher Unterstützung zu verhindern. Tumorzellen mit höheren Fähigkeiten der Tumorentstehung bei metastasiertem Websites generieren mehr Tumor Knötchen. Wenn die Tumorzellen spezifisches Organ Tropismus zeigen, Metastasen in den einzelnen Organen zu beachten. In diesem Test die ersten Schritte der metastatischen Kaskade (Primärtumor Wachstum und Invasion) sind nicht im Preis inbegriffen, und so im Mittelpunkt steht das Zusammenspiel von zirkulierenden Tumorzellen und die stromale Zellen (Endothelzellen, Epithelzellen und Blutzellen). In herkömmlichen Tumor Zelle Injektion Assays haben Forscher warten, bis der Tumor Knötchen wachsen auf eine konkrete Größe der Metastasen zu erkennen. In diesem Fall werden nicht die genaue Anzahl der Tumorzellen in den Blutgefäßen quantifiziert. Darüber hinaus enthält dieses Prozesses eine Tumor Regrowth Phase, darauf hinweist, dass andere Faktoren in den Tumorzellen das Ergebnis beeinflussen können.
Zählen ist beschriftet Tumorzellen unter eine Fluoreszenz Stereomikroskop ein einfacher Prozess. Das Stereomikroskop bietet ein breites Sichtfeld, so dass die ganze Lunge gescannt werden kann. Durchflusszytometrie ist auch ein nützliches Tool, das sofort eine genaue Anzahl von Tumorzellen in das Gewebe gibt. Ist auch möglich und zeigt die genauesten Bilder von metastatischen Tumorzellen zählen fluoreszierende Zellen in das Gewebe unter einem confocal Mikroskop, aber es ist zeitaufwändig und verzerrte Ergebnisse geben kann, wenn nur ein ausgewählter Bereich gezählt wird. Das Endziel dieser Assay ist zu beobachten, wie leicht die Tumor-Zellen in der Lunge ansammeln. Wie bereits berichtet3,4, wenn die Lunge durch entzündliche Signalisierung aus dem primären Tumor bereits Metastasen phasengleich sind, neigen die injizierten Tumorzellen in die Lunge, so impliziert höhere Chancen auf Lungenkrebs Metastasen ansammeln. Andere Bedingungen (rheumatoide Arthritis, Asthma, etc.) und deren Behandlung mit entzündungshemmenden Mitteln (z. B. Anti-TNF) kann Lungenkrebs Metastasen dämpfen. So schließen wir, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug ist um die Möglichkeit der Lunge Metastasen zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorbehandlung von Mäusen mit Antikörpern, Drogen, eine fettreiche Diät oder Tumor konditioniertes Medium vor der Tumor Zelle Injektion ist möglich. Der schwierigste Schritt in diesem Test ist das Heck Vene einspritzen. Unvollständiger Injektion führt nicht schlüssig Daten. Die Schweif Ader im C57BL/6 ist besonders schwer zu erkennen, was fehlerhafte Injektionen. Platzieren die Mäuse auf ein Heizkissen (37 ° C) erweitern hilft die Rute Vene so dass Injektion einfacher wird.
Dieser Assa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts
Materials
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
Referências
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