폐 종양 세포 모집 분석 결과

Summary

이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

종양 전이 경 세 하는 분자 메커니즘을 조사, 다양 한 분석 실험 모델 동물로 마우스를 사용 하 여 제안 되었습니다. 여기, 종양 세포 넘쳐 흐름 또는 micrometastasis를 평가 하기 위해 간단한 분석 결과 보여 줍니다. 이 분석 결과에서 종양 세포 꼬리 정 맥을 통해 주입 했다 고 짧은 기간 후 폐 해 부 되었고 누적된 레이블이 지정 된 종양 세포를 소화. 이 분석 결과 혈관으로 기본 종양의 초기 단계를 건너뛰고 먼 기관 종양 전이 발생 하는 위치에 있는 이벤트의 연구를 촉진 한다. 제한 된 수의 전이 관찰 하는 혈관에 주입 하는 셀의 수를 최적화할 수 있습니다. 그것은 알려졌다 stromal 셀 먼 장기에 전이에 기여. 따라서,이 분석 결과 잠재적인 치료 약물 이나 종양 전이의 방지를 위한 장치를 탐구 하는 유용한 도구 일 수 있었다.

Introduction

종양 전이 암 관련 질병에 높은 사망률을 차지 한다. 분자 수준에서 조사 관점에서 전이 여러 단계로 분할 될 수 있다: 기본 종양 사이트, 기본 종양 성장 및 주변 조직, intravasation, 혈관을 통해 순환으로 침공에 종양 개시 먼 장기에 종양이 다시 성장을 넘쳐 흐름. 각 단계는 분자/신호¹의 다른 세트를 포함 한다.

종양 세포는 또한로 알려져 미리 전이성 단계^{2,3,,45, 혈액에서 회람 시작 전에 먼 장기에 발생 하는 이벤트와 우려는 최신 연구 6}. 우리의 마우스 모델 연구 밝혔다 미리 전이성 단계 폐에 지속적인 저수준 염증 반응을 만들어 폐 전이 촉진 한다. 미리 전이성 단계 themicrovasculature의 hyperpermeability, 파생 하는 골 수 세포 (BMDC)의 신규 모집 그리고 S100A8 및 SAA3^3,4 를 포함 하 여 cytokine/chemokine 같은 분자의 upregulation 특징 이다 . 그것은 그 lysyl 산화 효소 BMDCs⁷을 폐에서 세포 외 매트릭스 수정 보고 되었습니다. 또 다른 보고서는 미리 전이성 단계⁸에서 Angpt2, MMP3, 및 MMP10의 중요성을 밝혔다. 즉, 1 차 종양, 골 수, 및 원격 기관 간의 복잡 한 상호 작용 해야 이해 하 고 제대로 (예를 들어, 사용 하 여 이러한 상호 작용에 관련 된 단백질을 대상으로 마약) 변조 미래 전이^{9 방지 하기 위해} . 미리 전이성 단계 규제를 그것은 해야 먼저 시각화 되며 진단 또는 치료 개입에 대 한 평가. 여기, 우리는 폐 종양 세포 모집 분석 결과 폐에 미리 전이성 위상의 연구를 가능 하 게 보고 합니다.

마우스의 혈관에 직접 주입 하는 종양 세포는 배양된 세포 사이 차이가 있을 수 있지만 암 환자에서 종양 세포를 순환 하 고 순환 종양 세포에 비슷합니다. 순환 종양 세포 스스로 받 다 몇 가지 특성 변경을 기본 종양에서 순환 들어가면. 그럼에도 불구 하 고, 배양된 세포 형성할 수 있다 종양 immunodeficient 쥐에서 꼬리 정 맥에 주사 하는 경우. 또한, 마우스 모델 시스템에서 종양 세포를 분류 하는 형광 사용할 수 있습니다 본문에이 셀의 추적을 허용 하는. 순환 종양 세포의 행동은 암 환자¹⁰에 궁극적인 결과 결정할 때 중요 합니다. 혈액 종양 세포²의 생존에 대 한 좋은 곳이 아니다. 그들은 숙주 면역 체계에 의해 공격에서 탈출 필요 실제 지원의 부족 때문에 apoptosis를 방지 하기 위해 안티-apoptotic 신호를 해야 합니다. 종양 세포에서 전이성 종양 개시의 높은 능력을 가진 더 많은 종양 작은 혹을 생성합니다. 종양 세포가 특정 기관 차 있는 굴곡 운동, 보여주면 그 특정 장기에 전이 관찰 해야. 이 분석 결과에서 전이성 캐스케이드 (기본 종양의 성장 및 내 습)의 초기 단계는 포함 하 고 그래서 초점은 순환 종양 세포 및 stromal 세포 (내 피 세포, 상피 세포와 혈액 세포) 사이 상호 작용에. 기존의 종양 세포 주입 분석 실험에서 연구팀은 종양 혹 전이 검출 하는 확실 한 크기에 성장 될 때까지 기다려야 했습니다. 이 경우에 혈관에 종양 세포의 정확한 수는 측정할 수 없는. 또한,이 과정에는 종양 세포에 있는 다른 요소는 결과 영향을 미칠 지 수를 나타내는 종양 자라나 단계를 포함 됩니다.

계산 간단한 과정은 종양 세포에서 형광 stereomicroscope 표시. stereomicroscope 전체 폐 스캔 수 있도록 넓은 시야를 제공 합니다. Cytometry 즉시 조직에서 종양 세포의 정확한 수를 제공 하는 유용한 도구 이기도 합니다. Confocal 현미경 조직에 형광 셀 계산도 가능 하 고 전이성 종양 세포의 가장 정확한 사진을 표시 하지만 시간이 많이 걸리는 이며 선택된 영역을 계산 하는 경우에 치우치는 결과 줄 수 있습니다. 이 분석 결과의 궁극적인 목표는 종양 세포는 폐에 축적 하는 방법을 쉽게 관찰 하는. 보고 이전^3,4, 미리 전이성 단계 기본 종양에서 염증 신호 때문에 폐가 하는 경우, 주입 된 종양 세포 폐 전이의 더 높은 기회를 암시 하는 따라서 폐에 축적 하는 경향이 있다. 다른 조건 (류 마티스 관절염, 천식, 등), 및 (안티-TNFα) 같은 항 염증 제 대리인 그들의 치료는 폐 전이 감소 수 있습니다. 따라서, 우리는이 분석 결과 폐 전이의 가능성을 평가 하는 강력한 도구입니다 결론.

Protocol

마우스를 사용 하 여 수행 하는 모든 절차는 동물 연구 위원회의 도쿄 여자의과 대학에 의해 승인 되었다. 1. 루이스 폐 암 (LLC) 세포의 꼬리 정 맥 주사 습도 5%에서 10 s 보충 DMEM LLC 셀 유지 37 ° c.에 CO2 배양 기 세포 형광 단백질 식 시스템 (예를 들어, GFP)를 포함 해야 합니다. 비 효소 세포 분리 시 약을 사용 하 여 문화 접시에서 셀을 제거 합니?…

Representative Results

폐 주사 (그림 1A) 후 많은 GFP LLC 셀 2 시간을 제공합니다. 그것은 또한 빨간 필터에 검출 형광 명소 셀 번호 개수에서 제외 되어야 주목 한다. LLC는 세포의 대부분 주사 (그림 1C) 후 폐 24 h에서에서 사라집니다. 폐에 GFP LLC의 번호를 확인 하는 돌출부의 흐름 cytometric 분석 (<strong class="xf…

Discussion

항 체, 약물, 높은 지방 다이어트 또는 종양 세포 주입 전에 종양 조절 중간 마우스의 전처리 가능 하다. 이 분석 결과 가장 어려운 단계가입니다 꼬리 정 맥 주입. 불완전 주입 결정적 데이터에서 발생합니다. C57BL/6에서 꼬리 정 맥은 실패 한 주사에 따른 식별, 특히 어렵습니다. 생리대 (37 ° C)에 쥐를 배치 도움이 되도록 주입 쉽게 꼬리 정 맥 팽창.

이 분석 결과 환자의 혈액에…

Materials

Collagenase	Sigma	C6885
Dispase	Gibco	17105-041
Bovine serum albumin	Sigma	A7030
DPBS	Gibco	14190-144	no calcium, no magnesium
Deoxyribonuclease I	Sigma	DN-25	trace amount
RBC lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer	BD	352340	40 micrometer mesh
Fluorescence labeling kit	Sigma	MIN26-KIT
DMEM	Gibco	11965-092
0.22 μm syringe filter	sartorius	17597K
O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145