Lunge svulst celle rekruttering analysen

Summary

Dette manuskriptet beskriver en metode for å kvantifisere svulst celle akkumulering i lungene i en dyremodell av svulst metastasering.

Abstract

For å undersøke de molekylære mekanismene som styrer svulst metastasering, foreslått ulike analyser ved hjelp av musen som en modell dyr. Her viser vi en enkel analysen for å evaluere svulst cellen bloduttredelse eller micrometastasis. I denne analysen, kreftceller ble injisert gjennom halen åre, og etter en kort periode, lungene ble dissekert og fordøyd vil telle akkumulert merket kreftceller. Denne analysen hopper det første trinnet av primære svulst invasjonen i blodkaret og muliggjør studiet av hendelsene i det fjerne orgelet der svulst metastasering skjer. Antall celler injiseres blodkaret kan optimaliseres for å observere et begrenset antall metastaser. Det har blitt rapportert at stromal celler i fjerne organ bidra til metastasering. Derfor kan denne analysen være et nyttig verktøy for å utforske potensielle terapeutiske narkotika eller enheter for forebygging av svulst metastasering.

Introduction

Svulst metastasering står for høy dødelighet i kreft-relaterte sykdommer. Fra synspunktet til undersøkelser på molekylært nivå, metastasering kan deles inn i flere trinn: svulst innvielse på primære svulst området, primære tumor vekst og invasjonen til omkringliggende vev, intravasation, sirkulasjon gjennom blod fartøy , bloduttredelse fjerne organer, og svulst ettervekst. Hvert trinn omfatter ulike sett av molekyler/signaler¹.

Studier hittil har vært opptatt av hendelser som forekommer i fjerne organer før kreftceller sirkulerer i blodet, som er også pre metastatisk fase^{2,3,4,5, 6}. Våre mus modell studier viste at den pre metastatisk fasen muliggjør lunge metastasering ved å skape varige og lavt nivå inflammatorisk respons i lungene. Pre metastatisk fasen er preget av hyperpermeability av themicrovasculature, rekruttering av benmarg avledet celler (BMDC) og oppregulering av cytokin/chemokine-lignende molekyler inkludert S100A8 og SAA3^3,4 . Det har blitt rapportert at lysyl oksidase endrer den ekstracellulære matrisen i lungene å rekruttere BMDCs⁷. En annen rapport har avdekket betydningen av Angpt2, MMP3 og MMP10 i den pre metastatisk fase⁸. Med andre ord, intrikate samspillet mellom primære svulster, benmargen og eksterne organer må bli forstått og riktig modulert (for eksempel ved å bruke narkotika som mål proteiner involvert i disse interaksjoner) å hindre fremtidige metastasering⁹ . For å regulere pre metastatisk fasen, bør først bli visualisert og vurdert for diagnostiske eller terapeutiske tiltak. Her rapporterer vi en lunge svulst celle rekruttering analysen som muliggjør studiet av pre metastatisk fase i lungene.

Kreftceller direkte injiseres i blodkaret museklikk er lik sirkulerende kreftceller i kreftpasienter, selv om det kan være forskjeller mellom kulturperler celler og sirkulerende kreftceller. Sirkulerende kreftceller gjennomgå selv noen karakteristiske endringer når de angir sirkulasjon fra den primære svulsten. Likevel kan kultivert cellene danner svulster i immunodeficient mus når de blir injisert i halen blodåre. I tillegg i mus modell systemet, kan fluorescens merket kreftceller brukes som tillater sporing av disse cellene i kroppen. Virkemåten av sirkulerende kreftceller er avgjørende som de bestemmer de endelige konsekvensene i kreft pasienter¹⁰. Blod er ikke et godt sted for overlevelse av tumor celler². De trenger å flykte fra angrep av immunsystemet vert og trenger anti-apoptotisk signaler å hindre apoptose på grunn av fysisk støtter. Kreftceller med høyere evner av svulst på metastatisk områder generere mer svulst nodules. Hvis kreftceller viser bestemte orgel tropism, praktiseres metastasering i de bestemt organene. De første trinnene i metastatisk kaskade (primære tumor vekst og invasjonen) er ikke inkludert i denne analysen, og så fokuset er på samspillet mellom sirkulerende kreftceller og stromal cellene (endotelceller, epitelceller og blodlegemer). Konvensjonelle svulst celle injeksjon analyser må forskere vente inntil svulsten knuter vokse til en håndgripelig størrelse å oppdage metastasering. I dette tilfellet kan kreftceller i blodkaret antallet ikke tallfestes. Denne prosessen inneholder i tillegg en svulst gjenvekst fase, som angir at andre faktorer i kreftceller kan påvirke utfallet.

Telle er merket kreftceller under en fluorescens stereomicroscope en enkel prosess. Stereomicroscope gir et bredt synsfelt, slik at hele lungene kan skannes. Flowcytometri er også et nyttig verktøy som umiddelbart gir et nøyaktig antall tumorceller i vevet. Telle fluorescerende celler i vevet under AC confocal mikroskop også og viser de mest nøyaktige bildene av metastatisk kreftceller, men det er tidkrevende og kan gi forutinntatte resultater hvis bare et merket område regnes. Det endelige målet med denne analysen er å observere hvor lett kreftceller akkumuleres i lungene. Som rapportert tidligere^3,4, hvis lungene er i pre metastatisk fase på grunn av inflammatoriske signalene fra den primære svulsten, er injisert kreftceller utsatt for akkumuleres i lungene, dermed noe høyere sjansene av lunge metastasering. Andre forhold (Revmatoid leddgikt, astma, etc.), og deres behandling med anti-inflammatoriske midler (for eksempel anti-TNFα) kan attenuere lunge metastasering. Derfor konkluderer vi at denne analysen er et kraftig verktøy for å vurdere muligheten for lunge metastasering.

Protocol

Alle prosedyrer utført med mus ble godkjent av dyr forskning komiteen av Tokyo kvinnenes medisinske universitet. 1. hale blodåre injeksjon av Lewis lunge Carcinoma (LLC) celler Opprettholde LLC celler i DMEM med 10% FCS, i en fuktet 5% CO2 inkubator på 37 ° C. Cellene må inneholde et fluorescerende protein uttrykk system (f.eks GFP). Fjerne celler fra kultur parabol ved hjelp av en ikke-enzymatisk celle dissosiasjon reagens. Følg produsentens proto…

Representative Results

Lungene presenterer mange GFP-LLC celler 2t etter injeksjon (figur 1A). Det bør bemerkes at de fluorescerende stedene også oppdaget i den røde filteret skal ekskluderes fra cellen antall. De aller fleste LLC celler forsvinner fra lungene 24 timer etter injeksjon (figur 1 c). For å bekrefte antall GFP-LLC i lungene, kan en av flikene brukes for flyt cytometric analys…

Discussion

Forbehandling for mus antistoffer, narkotika, en høy-fett diett eller svulst-conditioned medium før svulst celle injeksjon er mulig. Det vanskeligste trinnet i denne analysen er halen blodåre injeksjon. Ufullstendig injeksjon resulterer i ufullstendige data. Hale venen i C57BL/6 er vanskelige å identifisere, gir injeksjoner. Plassere mus på en varmeputen (37 ° C) dilate hjelper hale venen slik at injeksjon blir enklere.

Denne analysen bruker et stort antall (1 x 10⁴ – 1 x 10<s…

Materials

Collagenase	Sigma	C6885
Dispase	Gibco	17105-041
Bovine serum albumin	Sigma	A7030
DPBS	Gibco	14190-144	no calcium, no magnesium
Deoxyribonuclease I	Sigma	DN-25	trace amount
RBC lysis buffer	Sigma	R7757
Cell strainer	BD	352340	40 micrometer mesh
Fluorescence labeling kit	Sigma	MIN26-KIT
DMEM	Gibco	11965-092
0.22 μm syringe filter	sartorius	17597K
O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145