In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
ゼブラフィッシュは、神経筋疾患2,29の研究のための強力なツールとして浮上しています。現在までに、ゼブラフィッシュ系は、新たな筋疾患を引き起こす突然変異16,17,30を検証する新規な発症機序を解明18、及び潜在的に新しい治療薬12,24を識別するために使用されています。これらの集団的努力は、人間の神経筋疾患をモデル化するためにゼブラフィッシュの有用性を確立しています。しかし、ゼブラフィッシュおよび哺乳動物モデルで作られた進歩にもかかわらず、神経筋条件の広いスペクトル内の患者のための限られた治療の選択肢があります。そのため、高い需要が壊滅的な疾患のこのグループの治療法の開発のために存在します。治療のためのこの要求を並列接続すると、新しい動物モデルおよび推定治療戦略を検証するための継続的な実験技術革新だけでなく、厳密な分析のための対応が必要です。
EBDの分析は、一般的にマウスモデルで使用されています組織や脳、心臓、骨格筋27,31における細胞損傷を研究。最も顕著なのは、EBDは、筋膜の不安定性の深刻度を示し、8を損傷するために様々な筋ジストロフィーのサブタイプのマウスモデルにおいて広く使用されています。筋膜損傷を明らかにするEBDの使用は、ヒトの疾患状態9に動物モデルの類似性を確立支援するパラメータです。マウスではEBDの電力は、開発し、神経筋疾患のゼブラフィッシュのモデルにEBDを適用するために、私たち自身を含むいくつかの研究室が、リードしてきました。原因EBD分析の適用に、この技術は積極的にヒトの疾患状態11,15,22,24,32にゼブラフィッシュモデルを裏付けるために実施されています。損傷した筋肉の膜との幼虫は、筋線維内EBD取り込み、したがって、赤色の蛍光を持つことになります。蛍光は、繊維間の空間内に観察されたが、個々の筋線維内でTにおける基底膜から脱着繊維の有益かもしれません膜損傷の彼が不在、有用な診断の詳細を提供します。 EBD分析は、動物モデルの検証を超えた潜在的な用途を有しています。私たちの研究室からの努力は、最近EBD分析は、潜在的に新規の治療薬24を検証するのに有益であることを実証しました。潜在的な治療処置が軽減または関連する治療作用8を意味することができます神経筋疾患モデルにおけるEBD取り込みを廃止するかどうかの確認。このタイプの分析は、治療薬の機構(単数または複数)を確立する助けとEBD解析の適用を拡大することができます。
多くの技術と同様に、EBD解析は、実験計画と実践の間に観察するには、いくつかの注意点を持っています。例えば、それは、経年組織の肥厚にCCVを識別するために挑戦することができます。加えて、実験的な数を減少させ、幼虫の多数プリパレーションする必要性を増大させる、心膜注入前との間に調製物中の幼虫を損傷することは容易です。損傷した筋肉はEBDを取ることができますようにまた、取り扱いおよび注入中の幼虫に行っ物理的な損傷は、偽陽性になる可能性があります。これらの障害のいくつかを克服するために、我々は、注入の前、その後の分析に成功した直後に、色素注入と幼虫の簡単かつ信頼性のある同定を可能にするこのビデオ資料に共射出戦略を記載しています。前の筋線維によるその取り込みを血管系内のEBDの確認を可能にすることによって成功した注射用の共射出コントロールFITCデキストラン。筋線維に回収されていない場合EBD蛍光は、数時間後に幼虫に非常にびまん性になるように、これは特に有用である可能性があります。このように、検出するのが困難であることができます。また、CCVが欠落し、卵黄または体腔にEBDを注入して、インキュベーション後、胚を制御するために同様の拡散赤色蛍光で、まだ損傷した筋線維による取り込み可能性の減少をもたらすことができます。まとめると、これらの洞窟ATSはEBD注入が一貫して信頼性の高い結果を得るためには忍耐と練習が必要示唆しています。
すべてでは、我々は、ゼブラフィッシュの幼虫にEBD分析を実行するための実用的かつ簡単な方法を説明します。現在までに、モデル系としてゼブラフィッシュの使用は、特にヒト疾患モデルとして、急速に拡大しています。この拡張は、ゼブラフィッシュシステムの現在の利点を改良実験技術の継続的な開発と変更に部分的に起因しています。 EBD注入技術は、ゼブラフィッシュ筋疾患モデルの検証と研究のための研究者の兵器庫に追加し、強力なツールを提供します。この技術の継続的な実施と修正は、新規治療戦略だけでなく、疾患を引き起こすメカニズムを解明するのに役立つ可能性を秘めています。
The authors have nothing to disclose.
私たちは彼の技術支援のためのトレントウォーに感謝したいです。また、病気の子供や、このプロジェクトのために惜しみない資金調達のための治療先天性筋ジストロフィー(CMD)のための病院の小児科を認めます。
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |