This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.
يصف هذا البروتوكول بوضع العلامات على عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) على الخلايا الليفية COS7، واللاحق المتلازم المجهري مضان والمسح البيئي المجهر الإلكتروني (ESEM) من الخلايا الكاملة في ولاية المائية. اقترنت النقاط الكمومية الفلورسنت (QDS) لEGFR عبر بروتوكول وضع العلامات على مرحلتين، وتوفير وضع العلامات كفاءة ومحددة من البروتين، مع تجنب التجمعات التي يسببها التسمية للمستقبل. قدم مضان المجهر الصور نظرة عامة من المواقع الخلوية من EGFR. تم استخدام المجهر الإلكتروني النافذ المسح الضوئي (STEM) كاشف للكشف عن العلامات QD لقرار النانو. الصور المترابطة الناتجة توفر بيانات توزيع EGFR الخلوي، ورياضيات الكيمياء على المستوى الجزيئي واحد في السياق الطبيعي للخلية سليمة المائية. وكشفت الصور ESEM-STEM مستقبلات ليكون حاضرا كما مونومر، كما homodimer، وفي مجموعات صغيرة. وصفها مع اثنين من QDS مختلفة،أي واحد تنبعث منها في 655 نانومتر و 800 كشفت نتائج مميزة مماثلة.
كما تم تقديم نهج جديد في الآونة الأخيرة، إلى صورة خلايا كاملة مع البروتينات وصفت في الحالة السائلة باستخدام STEM 1-3، أو المتلازم المجهري مضان وSTEM 4-7. هذه المنهجية هي القادرة على دراسة التوزيع المكاني للبروتينات الغشاء والمجمعات البروتين بما في ذلك رياضيات الكيمياء على مستوى جزيء واحد في أغشية البلازما سليمة من الخلايا بأكملها. هنا، نحن تصف بروتوكول تنطوي على وضع العلامات المحددة من خطوتين من البروتينات المستقبلة مع نقاط الكم الفلورسنت (QDS) 8، والمتلازم المجهر الضوئي وESEM-STEM. وكمثال، درسنا EGFR، وهو بروتين الغشاء الذي ينتمي إلى الفصيلة بروتين كيناز. على يجند ملزمة، ومستقبلات ينشط ثم يشكل ديمر مع آخر EGFR المنشط؛ شلال إشارة لاحقة محركات تكاثر الخلايا 9. الطفرات غير طبيعي مما يؤدي إلى التعبير EGFR أو النشاط تلعب دورا مركزيا في أنواع عديدة من السرطان 10. ادرس فيز الترتيب المكاني لهذه المستقبلات في خلايا الغشاء كله يوفر معلومات سياق مهمة عن وظيفتها والتغييرات المحتملة منها 11-14. ولكنها لا تزال صعبة للتحقيق في توزيع أحادية EGFR، dimers، ومجموعات مباشرة على (شبه) المستوى الخلوي مع أساليب الفحص المجهري biochemical- أو التقليدية 15. أسلوبنا هو قادر على تصور EGFRs مع قرار المكاني لبضعة نانومتر هذه أن مواقع البروتينات في مجمع يمكن تحديدها. الأهم من ذلك، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها عن توزيع القياس المتكافئ تتعلق بالوضع الأصلي من البروتين في الخلية سليمة.
من أجل تحقيق مسافة قصيرة بين التسمية والمستقبلة، وEGFR المسمى مباشرة عبر EGF يجند لها، وذلك باستخدام السندات البيوتين streptavidin إلى QD. ويمكن الكشف عن هذه التسمية على حد سواء مع المجهر fluorescence- والإلكترون. وقد استخدمنا هذه التسمية للتصوير المتلازم الخلايا COS7 فيالسائل المغلقة في غرفة ميكروفلويديك سابقا 1،16،17. ومع ذلك، وعلى حساب من مضاعفات streptavidin الجزيئات في QD، هذه التسمية قد تحفز مستقبلات المجموعات، مما يؤدي إلى كفاءة وضع العلامات المنخفضة أو تجارب مكلفة نوعا ما، وأنه من غير الممكن التوصل إلى نتيجة بشأن رياضيات الكيمياء من البروتين قيد التحقيق. ويمكن تجنب التسمية التي يسببها تجمع مستقبلات تماما عن طريق استخدام إجراءات وضع العلامات من خطوتين المعروضة هنا، مما أدى إلى تحقيق تضم EGF المعقدة البيروكسيديز التي يقترن واحد فقط، streptavidin الكم نقطة (STR-QD). يتم تحضين الخلايا لأول مرة مع EGF المعقدة البيروكسيديز، ثم الثابتة. الخطوة تثبيت تحدد النقطة الوقت الذي توقفت عمليات البروتين (اعتمادا على سرعة التثبيت). يتم تطبيق STR-QD بعد ذلك كخطوة الثانية من بروتوكول وضع العلامات. التكتل لا يحدث منذ ديناميكية الحركة غشاء من البروتينات ما يعوق مرة واحدة يتم إصلاح البروتينات. وعلاوة على ذلك، فإن الحل STR-QD، الذي هومعظم مكونات مكلفة من التجربة، ويمكن تطبيقها في تركيز منخفض الأمثل، وهذه الخطوة الثانية من وضع العلامات ليست-وقت حاسم، أي QD يمكن أن تقترن في عدة دقائق.
لدراسة رياضيات الكيمياء من EGFR كما وزعت في الخلايا بأكملها، وكانت العينات الخلوية مستعدة على رقائق السليكون 18. بعد تطبيق العلامات QD من خطوتين، وتسجيل الصور مضان المجهر، وتشطف الخلايا مع الماء النقي، وتصويرها في دولة المائية باستخدام ESEM-STEM 19. توفر الصور المترابطة الناتجة المعلومات حول توزيع EGFR الخلوي، ورياضيات الكيمياء في السياق الطبيعي في الخلايا المائية. تم استخدام طريقة مماثلة لدراسة البروتينات HER2 في خلايا سرطان الثدي في دراسة حديثة 7.
دراسة التوزيع المكاني ورياضيات الكيمياء من البروتينات الغشاء، مثل EGFR في الخلايا الكاملة يقدم معلومات هامة حول سياق وظيفته والتغييرات المحتملة منها 11-14. أنه يمثل تحديا لدراسة توزيع أحادية، dimers، ومجموعات مباشرة على المستوى التحت خلوية باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية شائعة الاستخدام، والتي يتم فقدان المعلومات حول توطين البروتين في الخلية أو الاختلافات بين الخلايا 15. طرق وضع العلامات والفحص المجهري الموصوفة هنا تسمح التصور المجمعات البروتين على نطاق وطول بضعة نانومتر بحيث يمكن دراسة رياضيات الكيمياء في إطار سياق الفردية، خلايا سليمة 4-7. هذا غير ممكن مع (القرار السوبر) المجهر الضوئي 23 بسبب قرارها غير كافية لتمييز جزيئات تشارك في مجمع البروتين. نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) هو أسلوب المتوسط الفرقة <سوب> 24، ولم يكشف بالضرورة dimers ومجموعات أجل أعلى نتيجة من قصيرة المدى لنقل الطاقة 25. المقايسات ربط القرب 26 لا فعلا قياس المسافات، وبالتالي فهي غير قادرة على التمييز بين منطقة الخلوية ذات كثافة عالية من البروتين، لا محالة مما أدى إلى عدد من التقارب الكشف عن طريق الصدفة العشوائية، من منطقة الخلوية ذات كثافة البروتين مماثلة ولكن تحتوي على البروتين المجمعات معرض مسافات واضحة بين التسميات. ويتحقق المطلوب عالية الدقة لتصور مكونات مجمعات البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). ومع ذلك، TEM التقليدية الخلايا بأكملها محدودة بسبب متطلبات عينات رقيقة / من خلال تشريح غشاء البلازما 27، أو البلازما تمزيق غشاء أو فسخ 28،29 مما أدى إلى قطع صغيرة تشكلت عشوائيا من غشاء أقسام. وبالتالي لا تصوير غشاء البلازما ككل، مما يؤدي إلى نقصمن المحتمل المعلومات الحساسة السياق الخلوية.
تنشأ تحديات تجريبية أخرى لدراسة البروتين رياضيات الكيمياء في الخلايا من وضع العلامات البروتين التطبيقية. عادة immunolabeling المستخدمة يحمل الصعوبة التي رياضيات الكيمياء واحد الى واحد بين مستقبلات والتسمية يمكن أن يتحقق إلا مع تحقيق التكافؤ. هذا ليس هو الحال عندما يطلب من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. للحصول على معلومات عن رياضيات الكيمياء البروتين، وكان المطلوب أن التحقيق يربط فريد لحاتمة واحد على مستقبلات وله موقع ملزم واحد لتحقيق الفلورسنت أو جسيمات متناهية الصغر العدد الذري عالية على الجانب الآخر. ثانيا، ودقة للتحقيق مع الأجسام المضادة وضع العلامات يقتصر على حساب حجمها الكبير 30-30 نانومتر، بحيث التمييز بين البروتينات المجاورة واحدة، homodimers، أو مجموعات أكبر ليس ممكنا، على الأقل ليس لمستقبلات للأسرة EGFR. ومن المعروف تسميات محددة أصغر بكثير في الأدب وكاليفورنيان يتم تطبيقها حتى لوصفها الخلايا 31 ولكن هذه ليست شائعة الاستخدام. طول التسمية الكاملة (EGF-البيوتين streptavidin-QD) هو البعد مماثلة لEGFR، وصغيرة بما فيه الكفاية لتكون قادرة على الكشف عن ديمر. وعلاوة على ذلك، وصفت من خطوتين إجراءات وضع العلامات يتجنب وضع العلامات التي يسببها مستقبلات المجموعات.
لدينا وسيلة ليست صعبة جدا، وليس أكثر من ذلك بكثير من المجهري مضان من البروتينات المسمى. ومع ذلك، تحتاج تجربة لتنفذ بعناية كبيرة، لأن عدد من الخطوات يضيف صعودا وجود خطأ في واحدة من الخطوات التي قد تؤدي إلى الفشل الكامل في التجربة. التعامل مع الرقائق ليست أكثر مملة من التعامل مع شبكات TEM لكن بعض رقائق فارغة التدريب يوصى. ESEM-STEM الخلايا المائية كاملة وربما كان الجانب الأكثر صعوبة، ويتطلب على الأقل عامل المهرة وعدة أيام من الممارسة من أجل التوصل إلى قرار حول 3 نانومتر حسب الحاجة لتصور QDS. سد الإشعاععمر العينة قيد التحقيق يمثل خطرا. يجب أن يشاهد الضغط ودرجة الحرارة بعناية للحفاظ على طبقة المياه. وعلاوة على ذلك، وسمك طبقة المياه قد تختلف بين الخلايا. فإنه من المستحسن أن رصد وجود طبقة المياه باستخدام كاشف الإلكترون الغازي فوق العينة، كما هو موضح في مكان آخر 6. يجب تصوير المناطق الخلوية فقط مرة واحدة أو مرتين لتجنب الضرر.
وجود قيود أساسيا في الطريقة التي عالية الدقة من المعلومات عن التركيب الدقيق غائبة. تقنيات أخرى، على سبيل المثال، البرد TEM، وهناك حاجة لدراسة بنية البروتين، والتركيب الدقيق الخلوي 15. ثانيا، دراسة التفاعل الدينامي بين مضاعف من البروتينات في الخلية الحية في المجهر مرور الزمن ليست ذات جدوى بسبب أضرار الإشعاع، ويتطلب دولة من بين الفن المجهر الضوئي 23. حاليا، لدينا وسيلة غير قادر على تحديد المستوى المطلق للdimers منذ لتركفاءة abeling غير معروفة ولكننا نتوقع أن إضافة هذه البيانات في المستقبل. فمن الممكن مع ذلك لمعرفة ما إذا كان وجود أم لا dimers. من الأدب هو من المعروف، أنه حتى كفاءة الوسم حوالي 15٪ غير كافية للكشف عن dimers ذات دلالة إحصائية كافية 32.
فمن الممكن بسهولة لدراسة أخرى مستقبلات بغشاء عبر يجند لها، عبر شظايا فاب المعقدة البيروكسيديز من الاجسام المضادة المحددة، أو عن طريق linkers الصغيرة الأخرى 7 باستخدام وصفها من خطوتين بروتوكول وضع العلامات. وبما أننا أثبتنا بالفعل أن اثنين من ألوان مختلفة (أحجام) من QDS يمكن استخدامها، وكان يستخدم العلامات جسيمات متناهية الصغر من الذهب في العمل قبل 6، يبدو ممكنا لتسمية الأنواع بروتين متعددة في نفس التجربة. التحدي الرئيسي لدراسة رياضيات الكيمياء من أنواع البروتين متعددة هو ضمان كفاءة العلامات مماثلة لكل من الأنواع أو على الأقل تطبيع رياضيات الكيمياء النسبي الحصول على احترامإيف الكفاءة العلامات. ومع ذلك لا يبدو وهما QDS المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة تختلف كثيرا في كفاءة وضع العلامات (أنظر الشكلين 2 و 4). الطريقة الموصوفة التي تنطوي على وضع العلامات على مرحلتين مع QDS، والمتلازم المجهري مضان وESEM-STEM يقدم وسيلة فعالة لدراسة التفاعل المعقد للبروتينات الغشاء في أغشية البلازما سليمة من الخلايا بأكملها.
The authors have nothing to disclose.
We thank E. Arzt for his support through INM, M. Koch for help with the ESEM, and DENS Solutions for providing the microchips. Research in part supported by the Leibniz Competition 2013.
Inverted fluorescence microscope | Leica | AF6000 + DMI6000B | |
ESEM | FEI Company | Quanta 400 FEG | |
Chemicals | |||
DMEM (1x) + GlutaMax + glucose + pyruvate | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (1x) – Calcium chloride – Magnesium chlorid | Gibco | 14190-144 | |
Fetal bovine serum, Performance Plus (FBS) | Gibco | 16000-036 | |
Cellstripper | Mediatech, Inc. | 25-056 Cl | |
Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
PBS Roti-Stock 10x PBS | Carl Roth | 1058.1 | |
Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
Albumin Fraction V, biotin-free (BSA) | Carl Roth | O163.2 | |
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041-500G | |
Glycine | Carl Roth | T873.1 | |
shoul | Molecular Probes | E3477 | |
Sodium teraborate decahydrate | Sigma-Aldrich | S9640-500G | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | |
Qdot 655 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10121MP | |
Qdot 800 streptavidin conjugate | Molecular Probes | Q10173MP | |
Materials | |||
Silicon microchips with silicon nitride membranes | DENS Solutions | Custom made | |
of 50 nm thickness and dimensions of 50 µm x 0.40 mm |