Differentiatie van de SH-SY5Y Human Neuroblastoom Cell Line

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

De mogelijkheid om te gebruiken in vitro model systeem is sterk verbeterd op het gebied van neurobiologie en de neurowetenschappen. Cellen in cultuur zorgen voor een efficiënt platform om eiwitten functionaliteit en moleculaire mechanismen van specifieke verschijnselen te karakteriseren, aan de pathologie van de ziekte en infecties te begrijpen, en de voorlopige drugstests evaluaties uit te voeren. In neurobiologie, de belangrijkste soorten van celcultuur modellen omvatten primaire neuronale culturen afkomstig van ratten en muizen, en neuroblastoma cellijnen zoals ratten B35 cellen ^5, Neuro-2A muizencellen ^6, en ratten PC12 cellen ^7. Hoewel het gebruik van dergelijke cellijnen het veld is aanzienlijke vooruitgang geboekt, zijn er verschillende verstorende factoren die samenhangen met de behandeling van niet-menselijke cellen en weefsels. Deze omvatten begrip soort-specifieke verschillen in metabole processen fenotypen van ziekten manifestatie en pathogenese in vergelijking met mensen. Het is ook belangrijk om op te merken dat dere bestaan ​​aanzienlijke verschillen tussen muis en genexpressie van de mens en transcriptiefactor signalering, aandacht voor de beperkingen van diermodellen en het belang van inzicht in welke trajecten worden geconserveerd tussen knaagdieren en mensen ^8-11. Anderen hebben het gebruik van menselijke neuronale cellijnen met inbegrip van de N-Tera-2 (NT2) humane teratocarcinoom cellijn en induceerbare pluripotente stamcellen (iPSCs) toegepast. Deze cellijnen leveren goede modellen in vitro menselijke systemen. Echter, differentiatie NT2 cellen met retinoïnezuur (RA) resulteert in de vorming van een gemengde populatie van neuronen, astrocyten en gliacellen radiale ^12, noodzakelijk een extra zuiveringsstap zuivere populaties van neuronen te verkrijgen. Bovendien NT2 cellen vertonen een zeer variabele karyotype ^13, met meer dan 60 chromosomen in 72% van de cellen. iPSCs tonen variabiliteit in differentiatie tussen verschillende cellijnen en variëren in differentiatie efficiency ^14. Het is daarom wenselijk om een consistente en reproduceerbare menselijke neuronale cellen bij deze alternatieven aanvulling hebben.

SH-SY5Y neuroblast-achtige cellen zijn een subkloon van de ouderlijke neuroblastoma cellijn SK-N-SH. De ouderlijke cellijn werd gegenereerd in 1970 uit een beenmergpunctie dat zowel neuroblast-achtige en epitheliale-achtige cellen ¹⁵ bevat. SH-SY5Y cellen een stabiele karyotype bestaande uit 47 chromosomen, en kan worden onderscheiden van een neuroblast-achtige toestand tot volgroeide menselijke neuronen door een aantal verschillende mechanismen waaronder het gebruik van RA, forbolesters, en specifieke neurotrofinen zoals hersen- afgeleide neurotrofe factor (BDNF). Voorgeschiedenis suggereert dat het gebruik van verschillende methoden kan kiezen voor een specifieke neuron subtypen zoals adrenergische, cholinerge en dopaminerge neuronen ^16,17. Dit laatste maakt SH-SY5Y cellen bruikbaar voor een veelheid aan neurobiologie experimenten.

NHOUD "> Verschillende studies hebben belangrijke verschillen tussen de SH-SY5Y cellen in hun ongedifferentieerde en gedifferentieerde Staten genoteerd. Bij SH-SY5Y cellen ongedifferentieerd, ze zich snel vermenigvuldigen en lijken niet-gepolariseerde, met zeer weinig, korte processen te zijn. Ze groeien vaak in groepjes en expressie merkers indicatief onvolwassen neuronen ^18,19. bij gedifferentieerde, deze cellen verlengen lange, vertakte processen afname in proliferatie, en in sommige gevallen polariseren ^2,18. volledig gedifferentieerde SH-SY5Y cellen zijn eerder aangetoond dat een drukken verscheidenheid van de verschillende markers van volwassen neuronen waaronder groei geassocieerd eiwit (GAP-43), neuronale kernen (Neun), synaptophysine (SYN), synaptischeblaasjeseiwit II (SV2), neuron specifieke enolase (NSE) en de microtubule-geassocieerde eiwit (MAP) ^2,16,17,20, en de expressie van gliale merkers zoals gliacellen fibrillaire zuur eiwit (GFAP) ⁴ ontbreekt. In verdere ondersteuning die gedifferentieerde SH-SY5Y cellen VERTEGEnt een homogene neuronale populatie, verwijdering van BDNF resulteert in cellulaire apoptose ^4. Dit suggereert dat de overleving van gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen is afhankelijk van trofische factoren, vergelijkbaar neuronen rijpen.

Gebruik van SH-SY5Y cellen is sinds de subkloon werd in 1978 ^3. Voorbeelden van hun toepassing omvatten onderzoeken ziekte van Parkinson ^17, de ziekte van Alzheimer ²¹ en de pathogenese van virale infectie, waaronder poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , varicella-zoster virus (VZV) ^1, humaan cytomegalovirus ^25, en herpes simplex virus (HSV) ^2,26. Het is belangrijk op te merken dat verschillende studies met SH-SY5Y cellen zijn deze cellen in hun ongedifferentieerde vorm, met name op het gebied van Neurovirology ^27-36. Het verschil in de waargenomen fenotype van ongedifferentieerde versus gedifferentieerde SH-SY5Y cellen roept de vraag op whether de waargenomen progressie van de infectie zou anders in de volwassen gedifferentieerde neuronen zijn. Bijvoorbeeld gedifferentieerde SH-SY5Y cellen een hogere efficiëntie van HSV-1 opname versus ongedifferentieerde, prolifererende SH-SY5Y-cellen, die kunnen worden veroorzaakt door een gebrek aan oppervlaktereceptoren die HSV binden moduleren notitie gedifferentieerde SH-SY5Y cellen ^2. Het is daarom van groot belang dat bij het ​​ontwerpen van een experiment gericht op het testen van neuronen in vitro moeten SH-SY5Y-cellen worden gedifferentieerd om de meest nauwkeurige resultaten te vertalen en vergelijking met in vivo modellen te verkrijgen.

De ontwikkeling van een betrouwbare methode voor de menselijke neuronale culturen genereren noodzakelijk om onderzoekers translationele experimenten die het menselijk zenuwstelsel nauwkeurig modelleren voeren. Het protocol hier gepresenteerde is een procedure die 'best practices' afgeleid van de vorige methoden ^1-4 bakent te verrijken voor menselijke neuronen die worden onderscheidengebruik retinoïnezuur.

Protocol

1. Algemene overwegingen Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor een lijst van noodzakelijke reagentia. Voer alle stappen onder strikte aseptische omstandigheden. Gebruik warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS) voor alle media voorbereidingen die FBS bevatten. Aan hitte-geïnactiveerd, warm een 50 ml aliquot van FBS bij 56 ° C gedurende 30 min, omkeren elke 10 minuten (zie ook tabel 1). Opmerking: Als FBS wor…

Representative Results

Momenteel zijn er veel gevallen op het gebied van neurobiologie en Neurovirology waarbij gedifferentieerde SH-SY5Y cellen als een functioneel model voor humane neuronen 27-36, en belangrijker nog, ongedifferentieerde cellen missen fenotypes worden gebruikt, zoals virale optimale opname 2 die noodzakelijk voor nauwkeurige interpretatie. Het is essentieel dat bij gebruik van SH-SY5Y cellen of andere in vitro neuronale systeem, cellen gedifferentieerde in neuronen, om gegevens die de best mog…

Discussion

Het bovenstaande protocol voorziet in een eenvoudige en reproduceerbare methode om homogene en levensvatbare menselijke neuronale culturen te genereren. Dit protocol maakt gebruik van technieken en praktijken die een aantal eerder gepubliceerde werkwijzen ^{1-4 en} doelstellingen te integreren om de best practices van elkaar af te bakenen. Differentiatie van SH-SY5Y cellen berust op een geleidelijke serum deprivatie; de toevoeging van retinoïnezuur, neurotrofe factoren en extracellulaire matrixeiwitten; en seri…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–