La différenciation de la SH-SY5Y neuroblastome humain Cell Line

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

La possibilité d'utiliser dans des systèmes modèles in vitro a grandement amélioré les domaines de la neurobiologie et les neurosciences. Cellules en culture constituent une plate-forme efficace pour caractériser la fonctionnalité des protéines et des mécanismes moléculaires spécifiques phénomènes sous-jacents, de comprendre la pathologie de la maladie et l'infection, et d'effectuer des évaluations préliminaires de dépistage de drogues. En neurobiologie, les principaux types de modèles de culture de cellules comprennent des cultures de neurones primaires dérivées de rat et la souris, et des lignées cellulaires de neuroblastome comme les cellules B35 de rat ^5, des cellules de souris Neuro-2A ^6, et les cellules PC12 de rat ^7. Bien que l'utilisation de telles lignées cellulaires a progressé de façon significative le champ, il existe plusieurs facteurs de confusion liés à la manipulation des cellules non humaines et des tissus. Ceux-ci comprennent la compréhension spécifiques aux espèces différences dans les processus métaboliques, les phénotypes de la manifestation de la maladie, et la pathogenèse par rapport à l'homme. Il est également important de noter que lere des différences significatives entre la souris et l'expression de gènes humains et de la signalisation du facteur de transcription, en soulignant les limites des modèles de rongeurs et l'importance de comprendre quelles voies sont conservées entre les rongeurs et les humains ^8-11. D'autres ont eu recours à l'utilisation de lignées de cellules neuronales humaines, y compris la N-Tera-2 (NT2) de lignée humaine de cellules de tératocarcinome et cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi). Ces lignées cellulaires sont de bons modèles pour systèmes humains in vitro. Toutefois, la différenciation des cellules NT2 avec de l'acide rétinoïque (RA) a pour résultat la génération d'une population mixte de neurones, les astrocytes et les cellules gliales radiales ^12, ce qui nécessite une étape de purification supplémentaire afin d'obtenir des populations pures de neurones. En outre, les cellules NT2 montrent un caryotype très variable ^13, avec plus de 60% ​​en 72 chromosomes des cellules. iPSCs montrent la variabilité dans la différenciation entre les différentes lignées cellulaires et de modification de l'efficacité de la différenciation ^14. Il est donc souhaitable de disposer d'un modèle cellulaire neuronale humaine constante et reproductible pour compléter ces alternatives.

cellules neuroblastes comme SH-SY5Y sont un sous-clone de la lignée de cellules de neuroblastome parentale SK-N-SH. La lignée cellulaire parentale a été généré en 1970 à partir d'une biopsie de la moelle osseuse qui contient à la fois neuroblastes-like et les cellules épithéliales de type ^15. SH-SY5Y ont un caryotype stable constitué de 47 chromosomes, et peuvent être différenciés d'un état dans les neurones humains matures neuroblastes comme à travers une variété de mécanismes, y compris l'utilisation de la PR, les esters de phorbol et neurotrophines spécifiques tels que les brain-derived facteur neurotrophique (BDNF). Avant preuve suggère que l'utilisation de différentes méthodes peut sélectionner des sous-types spécifiques de neurones adrénergiques tels que, cholinergiques et des neurones dopaminergiques ^16,17. Ce dernier aspect fait SH-SY5Y utiles pour une multitude d'expériences de la neurobiologie.

ontenu "> Plusieurs études ont noté des différences importantes entre les cellules SH-SY5Y dans leurs états indifférenciées et différenciées. Lorsque les cellules SH-SY5Y sont indifférenciées, elles prolifèrent rapidement et semblent être non polarisée, avec très peu, des processus courts. Ils poussent souvent en touffes et d'exprimer des marqueurs indicatifs de neurones immatures ^18,19. Lorsque différencié, ces cellules étendent longs processus ramifié, diminution de la prolifération et, dans certains cas polarisent ^2,18. SH-SY5Y différenciées ont été entièrement précédemment démontré pour exprimer une variété de différents marqueurs de neurones matures, y compris des protéines de croissance associé (GAP-43), les noyaux neuronaux (NeuN), la synaptophysine (SYN), synaptique protéine vésiculaire II (SV2), neurone énolase spécifique (NSE) et la protéine associée aux microtubules (MAP) ^2,16,17,20 et à l'absence d'expression de marqueurs gliales telles que protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ^4. En outre soutien qui différencient SH-SY5Y represent une population neuronale homogène, l'enlèvement de BDNF se traduit par l'apoptose cellulaire ^4. Ceci suggère que la survie des cellules SH-SY5Y différenciées dépend de facteurs trophiques, semblables à des neurones matures.

L'utilisation de cellules SH-SY5Y a augmenté depuis le sous-clone a été créé en 1978 ^3. Quelques exemples de leur utilisation comprennent l'investigation de la maladie de Parkinson ^17, la maladie d'Alzheimer ^21, et la pathogenèse de l'infection virale dont poliovirus ^22, l'entérovirus 71 (EV71) ^23,24 , le virus varicelle-zona (VZV), ^{1, 25} cytomégalovirus humain et le virus de l'herpès simplex (HSV) ^2,26. Il est important de noter que plusieurs études utilisant des cellules SH-SY5Y ont utilisé ces cellules dans leur forme indifférenciée, en particulier dans le domaine de la neurovirologie ^27-36. La différence dans le phénotype observé des indifférenciée par rapport aux cellules SH-SY5Y différenciées soulève la question de whether la progression observée de l'infection serait différent dans les neurones différenciés matures. Par exemple, des cellules SH-SY5Y différenciées ont une plus grande efficacité de HSV-1 absorption en fonction, la prolifération des cellules SH-SY5Y indifférenciées, qui peuvent être dus à un manque de récepteurs de surface qui se lient HSV et modulent entrée sur les cellules SH-SY5Y indifférenciées ^2. Il est donc essentiel que lors de la conception d'une expérience axé sur les essais neurones in vitro, les cellules SH-SY5Y devraient être différenciés afin d'obtenir les résultats les plus précis pour la traduction et la comparaison avec des modèles in vivo.

Le développement d'une méthode fiable pour générer des cultures de neurones humains est impératif de permettre aux chercheurs de réaliser des expériences traductionnelles modéliser avec précision le système nerveux humain. Le protocole présenté ici est une procédure qui définit les meilleures pratiques issues de méthodes précédentes ^1-4 pour enrichir les neurones humains qui se différencientavec de l'acide rétinoïque.

Protocol

1. Considérations générales Voir la Table des Matières / Équipement pour la liste des réactifs nécessaires. Effectuez toutes les étapes dans des conditions aseptiques strictes. Utiliser du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (hiFBS) pour toutes les préparations de médias qui incluent FBS. Pour chauffer inactiver, chauffer 50 ml aliquote de FBS à 56 ° C pendant 30 min, en inversant toutes les 10 min (voir également le tableau 1). Remarq…

Representative Results

À l'heure actuelle, il existe de nombreux cas dans le domaine de la neurobiologie et neurovirologie où SH-SY5Y indifférenciées sont utilisés comme un modèle fonctionnel pour les neurones humains 27-36, et surtout, des cellules indifférenciées peuvent manquer phénotypes tels que optimale absorption virale 2 qui sont nécessaire pour une interprétation précise. Il est essentiel que l'utilisation de cellules SH-SY5Y ou tout autre système neuronale in vitro, les cellules se…

Discussion

Le protocole ci-dessus fournit une méthode simple et reproductible pour produire des cultures de neurones humains homogènes et viables. Ce protocole utilise des techniques et des pratiques qui intègrent plusieurs méthodes publiées antérieurement ^{1-4 et} a pour objectif de définir les meilleures pratiques de chacun. La différenciation des cellules SH-SY5Y repose sur la privation de sérum progressive; l'addition de l'acide rétinoïque, les facteurs neurotrophiques et les protéines de la matric…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–