A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco
Summary
Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.
Abstract
As espinhas dendríticas são pequenas saliências que correspondem aos compartimentos pós-sinápticas das sinapses excitatórias no sistema nervoso central. Eles estão distribuídos ao longo dos dendritos. A sua morfologia é em grande parte dependente da actividade neuronal, e eles são dinâmicos. Espinhas dendríticas expressam receptores glutamatérgicos (receptores AMPA e NMDA) em sua superfície e nos níveis de densidade pós-sináptica. Cada coluna permite que o neurônio para controlar sua atividade estatal e local de forma independente. Spine morfologias têm sido extensivamente estudadas em células piramidais glutamatérgicos do córtex cerebral, usando ambas as abordagens in vivo e culturas neuronais obtidos a partir de tecidos de roedores. Condições neuropatológicas podem ser associados à indução da coluna alterada e maturação, como mostrado em roedores neurónios em cultura e análise quantitativa unidimensional 1. O presente estudo descreve um protocolo para a análise quantitativa 3D de morfologias coluna usando cortic humanoneurônios al derivadas de células estaminais neurais (progenitoras corticais final). Estas células foram inicialmente obtida a partir de células estaminais pluripotentes induzidas. Este protocolo permite a análise da morfologia da coluna vertebral em diferentes períodos de cultura, e com a possibilidade de comparação entre as células-tronco pluripotentes induzidas obtidas de indivíduos controle com aqueles obtidos de pacientes com doenças psiquiátricas.
Introduction
Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais corticais são pequenas e finas saliências que são distribuídos ao longo das dendrites basais e apicais de esses subtipos neuronais em roedores, primatas e cérebro humano. Eles são os sites da maioria das sinapses excitatórias e exibir funções-chave na aprendizagem e processos cognitivos. As estruturas detalhadas de espinhas dendríticas humanas foram tecnicamente estudada por microscopia eletrônica de 2. No entanto, tal abordagem é demorado e representa a carga de trabalho pesado. Mais recentemente, um (3D) reconstrução tridimensional da morfologia das espinhas dendriticas foi reportado no córtex do cérebro humano utilizando um software específico combinados para análise grande coluna Manual 3.
A tecnologia verde proteína fluorescente (GFP) acoplado a imunofluorescência representa uma ferramenta precisa para a identificação e medição espinha forma por microscopia de fluorescência. Esta abordagem pode ser facilmente aplicado a culturas de neurónios. However, há dados foram relatados na análise de maturação coluna e morfologia em neurônios humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC).
O objetivo deste estudo foi descrever um protocolo, que permite imagens espinha dendrítica de neurônios humanos cultivados in vitro. Rotulagem GFP, microscopia confocal e análise 3D com o módulo de software de Filamento Tracer Imaris foram utilizados no presente protocolo. Culturas etapas que são necessárias para obter neurónios glutamatérgicos do córtex das camadas II a IV a partir de células estaminais neurais (NSC) também são brevemente descritos aqui. Todo o protocolo para a produção NSC humano já foi publicado em outros lugares 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
A quantificação das características morfológicas dos neurônios piramidais contou com o software. A interface Filament Tracer foi utilizada para a segmentação de neurônios e espinhos, eo módulo XT foi utilizado para suas análises.
Para analisar a precisão da nossa técnica, primeiro comparou os parâmetros morfológicos medidos (comprimento, área e volume total de espinha quando aplicável), com os publicados usando ratos neurônios piramidais maduros na cultura 6, 7 e …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
Referências
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neurociência. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
