Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een<em> Gaussia</em> Luciferase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
Het endoplasmatisch reticulum (ER) bevat het hoogste niveau van intracellulair calcium, bij concentraties die ongeveer 5000-voudig hoger dan cytoplasmatische niveaus. Strakke controle over ER calcium is noodzakelijk voor het vouwen van eiwitten, modificatie en mensenhandel. Storingen ER calcium leidt tot activering van het ongevouwen eiwit respons, een driepolige ER stress respons mechanisme, en bijdragen aan de pathogenese van diverse ziekten. De mogelijkheid om ER calcium veranderingen volgen tijdens begin van de ziekte en progressie van belang in principe maar uitdagende praktijk. Momenteel beschikbare methoden voor de controle ER calcium, zoals calcium-afhankelijke fluorescerende kleurstoffen en eiwitten hebben inzicht gegeven in ER calcium dynamiek in cellen, maar deze instrumenten zijn niet geschikt voor in vivo studies. Ons laboratorium heeft aangetoond dat een wijziging van het carboxy-uiteinde van Gaussia luciferase verleent uitscheiding van de reporter als reactie opER calciumdepletie. De werkwijzen voor het gebruik van luciferase gebaseerde, afgescheiden ER calciumspiegel eiwit (SERCaMP) in vitro pt in vivo toepassingen worden hierin beschreven. Deze video belicht de lever injecties, farmacologische manipulatie van Gluc-SERCaMP, bloedafname en verwerking, en test parameters voor longitudinale monitoring van ER calcium.
Introduction
Het endoplasmatisch reticulum (ER) functies in vele cellulaire capaciteiten zoals het vouwen van eiwitten, eiwit secretie, lipide homeostase, en intracellulaire signalering 1. Centraal in normale ER functie handhaaft luminale calciumconcentraties bij ~ 5000 keer die gevonden in het cytoplasma 2-4. Deze energie-intensief proces wordt gereguleerd door de Sarco / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), een pomp die calciumionen verhuist naar de ER. Efflux van calcium uit het ER wordt gemedieerd voornamelijk door de ryanodine (RyR) en inositoltrifosfaat (IP3R) receptoren. Omdat veel ER processen zijn afhankelijk van calcium, verstoren de winkel kan leiden tot ER stress en uiteindelijk celdood.
ER calcium disregulatie waargenomen bij ziekten zoals cardiomyopathie, diabetes, ziekte van Alzheimer en Parkinson 5. Als gevolg van het progressieve karakter van deze ziekten, is het een uitdaging om de oorzaak-effect opnieuw af te bakenenlationship tussen pathogenese en veranderingen in de ER calcium winkel. Een aantal technologieën hebben geleid tot significante vooruitgang in ons begrip van ER calcium dynamiek, waaronder kleurstoffen en genetisch gecodeerd calcium indicatoren (Geçiş). Lage affiniteit calcium kleurstoffen, die toenemen in fluorescentie indien gebonden aan Ca2 +, kan in cellen worden geladen subcellulaire compartimenten met een hoge concentratie calcium 6 onderzocht. Geçiş, zoals D1ER en catcher zorgen voor monitoring van calcium fluctuaties met meer nauwkeurige controle van de subcellulaire lokalisatie 7-9. Onlangs, een andere klasse van Geçiş genoemd calcium meten organel ingesloten eiwit indicators (CEPIA) beschreven 10. Een derde benadering combineert genetica en kleine molecule chemie is gericht loading dye-esterase (TED), waarin een genetisch gecodeerde carboxylesterase (gericht naar de ER) met een op ester gebaseerde calcium kleurstof 11 gebruikt.
Terwijl de AFORementioned benaderingen hebben inherente sterke en zwakke punten, kunnen ze waardevol inzicht in ER calcium dynamiek bieden door middel van acute metingen van de fluorescentie. Ze zijn echter niet optimaal voor longitudinale studies vaak vereist om ziekteprogressie te onderzoeken. Met als doel het ontwerpen van een werkwijze voor calciumdynamiek monitoren gedurende langere tijdsperioden, identificeerden we en ontwikkelde een eiwit wijziging van het uitgescheiden ER calcium controle eiwitten (SERCaMPs) 12 maken.
SERCaMP omzeilt verscheidene beperkingen geassocieerd met andere methoden, door een minimaal invasieve benadering herhaaldelijk ondervragen de ER calcium opslag. We hebben eerder aangetoond dat het carboxy-eindstandige peptide ASARTDL (alanine-serine-alanine-arginine-threonine-asparaginezuur-leucine) voldoende is om ER retentie te bevorderen; echter, onder omstandigheden die leiden tot afname in ER calcium, de peptidesequentie niet meer kan handhaven ER localization en het eiwit wordt uitgescheiden 13. De basis van de SERCaMP technologie is het aanhangsel van ASARTDL het carboxy-uiteinde van een uitgescheiden eiwit (bijv Gaussia luciferase of gluc) zodanig dat secretie veroorzaakt door ER calciumdepletie, waardoor een robuuste reporter van ER calcium disregulatie 12. De expressie van gluc-SERCaMP via transgene werkwijzen maakt biologische vloeistoffen zoals celkweekmedium en plasma worden geanalyseerd op veranderingen in gluc activiteit als indicator van ER calcium homeostase. De werkwijze heeft toepassingen voor longitudinaal onderzoek progressieve veranderingen in het ER calcium opslag zowel in vitro als de vivo. Het volgende protocol is geschreven als een algemene schets voor het gebruik van gluc-gebaseerde SERCaMP ER calciumhomeostase studeren, maar het protocol kan dienen als leidraad voor alternatieve reporter SERCaMPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wijst op de in vitro pt in vivo bruikbaarheid van gluc-SERCaMP uitputting van ER calcium te controleren. Hoewel het eiwit wijziging SERCaMP genereren lijkt te generaliseren naar andere reporter eiwitten 12, kozen we Gaussia luciferase voor zijn robuuste (200-1000 keer groter) bioluminescentie in vergelijking met andere luciferasen 18. We tonen detecteerbare thapsigargin geïnduceerde Gluc-SERCaMP afgifte over een 100-voudige dosisbereik van gluc-virus SERCaMP…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
Referências
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
