एक का उपयोग जालिका कैल्शियम हेमोस्टेटिस निगरानी<em> Gaussia</em> Luciferase SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
जालिका (ईआर) सांद्रता लगभग साइटोप्लास्मिक स्तर की तुलना में अधिक से अधिक 5,000 गुना साथ intracellular कैल्शियम के उच्चतम स्तर होते हैं। ईआर कैल्शियम पर कड़ा नियंत्रण प्रोटीन तह, संशोधन और तस्करी के लिए जरूरी है। ईआर कैल्शियम को अव्यवस्थाएं सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया, एक तीन शूल ईआर तनाव प्रतिक्रिया तंत्र की सक्रियता के परिणाम में, और रोगों की एक किस्म में रोगजनन के लिए योगदान कर सकते हैं। रोग की शुरुआत और प्रगति के दौरान ईआर कैल्शियम परिवर्तन नजर रखने की क्षमता व्यवहार में सिद्धांत रूप में महत्वपूर्ण है, अभी तक चुनौतीपूर्ण है। जैसे कैल्शियम निर्भर फ्लोरोसेंट रंगों और प्रोटीन के रूप में निगरानी ईआर कैल्शियम के लिए वर्तमान में उपलब्ध तरीकों, लेकिन इन उपकरणों में vivo अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल नहीं हैं, कोशिकाओं में ईआर कैल्शियम की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हमारी प्रयोगशाला Gaussia luciferase की carboxy टर्मिनस के लिए एक संशोधन के जवाब में रिपोर्टर के स्राव प्रदान दिखा दिया है किईआर कैल्शियम की कमी। इन विट्रो के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में एक luciferase आधारित, स्रावित ईआर कैल्शियम निगरानी प्रोटीन (SERCaMP) का उपयोग करने के लिए तरीकों के साथ साथ वर्णित हैं। यह वीडियो ईआर कैल्शियम के अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए यकृत इंजेक्शन, gluc-SERCaMP, रक्त संग्रह और प्रसंस्करण के औषधीय हेरफेर, और परख के मापदंडों पर प्रकाश डाला गया।
Introduction
जालिका (ईआर) एक संकेत प्रोटीन तह, प्रोटीन स्राव, लिपिड समस्थिति, और intracellular सहित कई सेलुलर क्षमताओं में कार्य करता है। सामान्य ईआर समारोह के लिए केन्द्रीय ~ 5,000 बार में ल्यूमिनल कैल्शियम की सांद्रता कोशिका द्रव्य 2-4 में पाए जाने वाले को बनाए रखते है। यह ऊर्जा गहन प्रक्रिया SARCO / जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA), ईआर में कैल्शियम आयनों चलता है कि एक पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है। ईआर से कैल्शियम की तपका मुख्य रूप से ryanodine (RYR) और inositol ट्रायफ़ोस्फेट (IP3R) रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता है। कई ईआर प्रक्रियाओं कैल्शियम पर निर्भर होते हैं, क्योंकि दुकान में खलल न डालें ईआर तनाव और अंततः सेल मौत हो सकती है।
ईआर कैल्शियम अनियंत्रण, कार्डियोमायोपैथी, मधुमेह सहित अल्जाइमर रोग में देखा गया है, और पार्किंसंस 5। इन रोगों के प्रगतिशील प्रकृति के कारण, यह कारण प्रभाव फिर से चित्रित करने के लिए चुनौती रहा हैईआर कैल्शियम की दुकान में रोगजनन और परिवर्तन के बीच संबंधों। प्रौद्योगिकियों के एक नंबर के रंगों और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIS) सहित ईआर कैल्शियम गतिशीलता, के बारे में हमारी समझ में उल्लेखनीय प्रगति के लिए अनुमति दी है। सीए 2 के लिए बाध्य जब प्रतिदीप्ति में वृद्धि, जो कम आत्मीयता कैल्शियम रंजक, कैल्शियम 6 की उच्च सांद्रता के साथ subcellular डिब्बों की जांच करने के लिए कोशिकाओं में लोड किया जा सकता है। ऐसे D1ER और पकड़ने के रूप में GECIS, subcellular स्थानीयकरण 7-9 से और अधिक सटीक नियंत्रण के साथ कैल्शियम उतार चढ़ाव की निगरानी के लिए अनुमति देते हैं। हाल ही में, GECIS का एक अन्य वर्ग कहा जाता कैल्शियम मापने organelle-फँस प्रोटीन संकेतक (Cepia) 10 वर्णित किया गया है। आनुवंशिकी और संयोजन के लिए एक तीसरा दृष्टिकोण छोटे अणु रसायन शास्त्र है लक्षित-esterase डाई लोड हो रहा है एक एस्टर आधारित कैल्शियम डाई 11 के साथ (ईआर के लिए लक्षित) एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग carboxylesterase इस्तेमाल करता है जो (टेड),।
Afor जबकिementioned दृष्टिकोण वे प्रतिदीप्ति की तीव्र माप के माध्यम से ईआर कैल्शियम की गतिशीलता में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, निहित शक्तियों और कमजोरियों है। उन्होंने, हालांकि, अक्सर रोग प्रगति की जांच के लिए आवश्यक अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं। समय की विस्तारित अवधि में कैल्शियम की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए एक विधि तैयार करने के लक्ष्य के साथ, हम पहचान और स्रावित ईआर कैल्शियम की निगरानी प्रोटीन (SERCaMPs) 12 बनाने के लिए एक प्रोटीन संशोधन विकसित की है।
SERCaMP बार-बार ईआर कैल्शियम की दुकान से पूछताछ करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करके, अन्य तरीकों के साथ जुड़े कई सीमाओं में गतिरोध उत्पन्न। हम पहले carboxy टर्मिनल पेप्टाइड ASARTDL (एलनाइन-सेरीन-एलनाइन-arginine-threonine एसपारटिक एसिड ल्यूसिन) ईआर अवधारण को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त है कि प्रदर्शन किया है; हालांकि, ईआर कैल्शियम में घटने का कारण है कि शर्तों के तहत, पेप्टाइड अनुक्रम नहीं रह ईआर localizatio बनाए रखने में सक्षम हैn और प्रोटीन 13 स्रावित होता है। SERCaMP प्रौद्योगिकी के आधार एक स्रावित प्रोटीन की carboxy टर्मिनस स्राव इस प्रकार ईआर कैल्शियम अनियंत्रण 12 के एक मजबूत रिपोर्टर बनाने, ईआर कैल्शियम की कमी से शुरू हो रहा है कि इस तरह के (जैसे Gaussia luciferase, या gluc) को ASARTDL के उपांग है। ट्रांसजेनिक विधियों के माध्यम से gluc-SERCaMP की अभिव्यक्ति ईआर कैल्शियम homeostasis के एक संकेत के रूप gluc गतिविधि में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से और प्लाज्मा सहित जैविक तरल पदार्थ में सक्षम बनाता है। विधि इन विट्रो और इन विवो में दोनों ईआर कैल्शियम की दुकान में प्रगतिशील परिवर्तन के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए आवेदन किया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ईआर कैल्शियम homeostasis को अध्ययन करने के लिए gluc आधारित SERCaMP प्रयोग करने के लिए एक सामान्य रूपरेखा के रूप में लिखा गया है, लेकिन प्रोटोकॉल विकल्प संवाददाता SERCaMPs के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो पर प्रकाश डाला गया और gluc-SERCaMP की विवो उपयोगिता में ईआर कैल्शियम की कमी नजर रखने के लिए। SERCaMP उत्पन्न करने के लिए प्रोटीन संशोधन अन्य संवाददाता प्रोटीन से 12 सामान्य?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
Referências
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
