Hele netvlies Explantaten van kippenembryo's voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen
Summary
Dit protocol beschrijft een methode te ontleden, experimenteel manipuleren en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explantkweken zijn bruikbaar wanneer hoge succespercentage, werkzaamheid en reproduceerbaarheid nodig om de effecten van elektroporatie van plasmiden en / of reagens stoffen, dat wil zeggen enzymatische inhibitoren testen.
Abstract
Het netvlies is een goed model voor de ontwikkeling van centrale zenuwstelsel. De grote omvang van het oog en vooral de toegankelijkheid voor experimentele manipulaties in ovo / in vivo maakt de kip embryonale retina een veelzijdig en zeer efficiënt experimenteel model. Hoewel de kip netvlies gemakkelijk te richten in ovo door intraoculaire injectie of elektroporatie, kan de doeltreffende en nauwkeurige concentratie van de reagentia in de retina moeilijk volledige controle. Dit kan te wijten zijn aan variaties van de exacte injectieplaats, lekkage uit het oog of ongelijkmatige verspreiding van de stoffen. Bovendien is de frequentie van misvorming en mortaliteit na invasieve manipulaties zoals elektroporatie is vrij hoog.
Dit protocol beschrijft een ex ovo techniek voor het kweken gehele netvlies explantaten van kippenembryo's en een werkwijze voor gecontroleerde blootstelling van de retina reagentia. De protocol beschrijft hoe te ontleden, experimenteel te manipuleren, en cultuur hele netvlies explantaten uit kippenembryo's. De explanten worden gekweekt gedurende ongeveer 24 uur en onderworpen aan verschillende manipulaties zoals elektroporatie. De belangrijkste voordelen zijn dat de proef niet afhankelijk van de overleving van het embryo en de concentratie van de reagentia kunnen worden gevarieerd en gecontroleerd teneinde te bepalen en optimaliseren de effectieve concentratie. Bovendien is de techniek is snel, goedkoop en samen met zijn hoge experimentele slagingspercentage, het zorgt reproduceerbaar resultaten. Benadrukt moet worden dat het dient als een uitstekende aanvulling op experimenten uitgevoerd in ovo.
Introduction
Het netvlies is onderdeel van het centrale zenuwstelsel en is met zijn relatieve eenvoud en goed gekarakteriseerde cellulaire architectuur, een populair model voor de studie van ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel. Het oog van het kippenembryo relatief groot in vergelijking met de rest van het embryo. Het is dus gemakkelijk toegankelijk de ovo voor experimentele manipulaties, zoals injecties of elektroporatie, en vormt een uitstekend hulpmiddel om kennis retinale cel en ontwikkelingsbiologie in vivo te verkrijgen. Ondanks deze grote voordelen kan overleving van de embryo's laag zijn wanneer experimenten invasieve zoals bij electroporations, herhaalde injecties of gecombineerde experimentele manipulaties.
Elektroporatie van DNA plasmiden in het kippenembryo in ovo is een belangrijke en gevestigde techniek 1. Het maakt het kenmerken van neuronen, het traceren van lot van de cel en neuronale stukken in het centrale Nervous systeem en maakt ectopische genexpressie te analyseren eiwitfunctie in vivo. De techniek is gebruikt voor studies van neurale buis 2, achterhersenen 3 pt 4 retina. Elektroporatie van de embryonale retina in ovo heeft enkele experimentele problemen die verband houden met de in vivo situatie. De positie van het oog, vanwege het craniale vouwen van het embryo, relatief dicht bij het hart. Deze nabijheid verhoogt het risico van een hartstilstand elektroporatie, en het risico neemt toe met de leeftijd van het embryo. Bovendien, om het oog, is het noodzakelijk om de embryonale membranen openen, waardoor het risico van bloeden, misvormingen en daaropvolgende verminderde levensvatbaarheid verhogen. Bij het testen en optimaliseren van een nieuwe DNA-plasmide vaak zonder een bekende fenotypische resultaat, kunnen deze beperkingen de effectiviteit en kracht van de werkwijze, zelfs voor een ervaren experimentator verminderen. Zoals gepresenteerd in dit protocol, de cultuur van de whole retinale explantatie, gedefinieerd als het geheel neurale retina met pigment epitheel verwijderd, is een efficiënte methode die een aanvulling op de in ovo benadering.
Intraoculaire injecties van chemische reagentia relatief gemakkelijk uit te voeren in ovo. Toch kan de doeltreffende en nauwkeurige concentratie ingespoten reagentia in de neurale retina moeilijk volledig te controleren. De geïnjecteerde volume kan variëren als gevolg van lekkage en de exacte plaats van injectie kan zowel de verdeling van de reagens binnen het oog en de diffusie door het glasachtig lichaam beïnvloeden. De variabiliteit heeft grote gevolgen voor de interpretatie van de resultaten bij dwz een dosis respons curve voor een enzymremmer bepaald hebben; vooral als het effect klein en de vensterfuncties van het effect is smal. Bovendien kan slechts één oog worden uit elk embryo bij het uitvoeren van in ovo experimenten vanwege mogelijke systemische effecten via de bloedstroomop het contralaterale oog. Leeftijd matching is belangrijk bij het bestuderen van de ontwikkeling en de individuele variatie tussen behandelde en controle embryo's kan leiden tot extra experimentele variabiliteit.
Daarom ex ovo methode gebaseerd op retinale explantaten van kippenembryo's ontwikkeld, waarbij de neurale retina kan worden blootgesteld aan een uniform en gecontroleerde experimentele conditie in vitro. Het huidige protocol is ontwikkeld op basis van eerdere protocollen 5-9. Retinale explantaten uit stap (e) 20 (embryonale dagen [E] 3) naar ST31 (E7) kippenembryo's werden ontleed, gekweekt en geëlektroporeerd met een gedefinieerde DNA plasmideconcentratie of blootgesteld aan een medium met een bepaalde concentratie van een chemisch reagens. De hier gepresenteerde protocol is met succes geïmplementeerd in recente publicaties, met behulp van verschillende chemische stoffen, met inbegrip van toezichthouders van de DNA-schade route, zoals KU55933, SB 218.078 en NSC 109.555 ditosylate en de celcyclus, zoals Cdk1 / 2 inhibitor III 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk een gedetailleerd protocol voor dissectie, elektroporatie of chemische behandeling, en het kweken van hele netvlies explantaten van kippen embryo's wordt gepresenteerd. Dit protocol is eenvoudig, snel en zorgt voor zowel een hoog slagingspercentage en reproduceerbare resultaten.
Elektroporatie van gehele netvlies explantaten produceert grote delen van cellen die het gen construct van interesse te tonen. Het is gemakkelijk om de juiste positie van de elektro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
