Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

Summary

Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.

Abstract

A retina é um bom modelo para o sistema nervoso central em desenvolvimento. O grande tamanho do olho e, mais importante a acessibilidade para manipulações experimentais em ovo / in vivo torna o frango retina embrionária um modelo experimental versátil e muito eficiente. Embora a retina da galinha é fácil de atingir in ovo por injecções intra-oculares ou electroporação, e a concentração eficaz exacta dos reagentes no interior da retina pode ser difícil de controlar totalmente. Isto pode ser devido a variações do local da injecção exacta, vazamento a partir do olho ou difusão desigual das substâncias. Além disso, a frequência de malformações e mortalidade após manipulações invasivos, tais como electroporação é bastante elevada.

Este protocolo descreve uma técnica ex ovo para a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha e proporciona um método para a exposição controlada da retina para reagentes. O protocol descreve como dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura inteiros a partir de embriões de galinha. Os explantes podem ser cultivados durante cerca de 24 horas e ser submetidos a manipulações diferentes, tais como electroporação. As principais vantagens são que a experiência não é dependente a sobrevivência do embrião e que a concentração do reagente introduzido pode ser variado e controlado, a fim de determinar e optimizar a concentração eficaz. Além disso, a técnica é rápida, barata e juntamente com a sua elevada taxa de sucesso experimental, que garante reprodutível resultados. Deve-se ressaltar que ele serve como um excelente complemento para experimentos realizados in ovo.

Introduction

A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com e....

Protocol

Este protocolo é realizada de acordo com as recomendações contidas no "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia".

1. Egg Manuseio e coleção dos olhos

1. Armazenar ovos brancos Leghorn em 12-14 ° C durante não mais de uma semana. Se possível, use um refrigerador de vinho refrigerado para armazenar os ovos fertilizados.
   Nota: temperaturas mais elevadas armazenar levar ao desenvolvimento anormal dos embriões, enquanto temperaturas mais baixas aumenta a mortalidade. Tempo de armazenamento prolongado aumenta a mortalidade e desenvolvimento anormal.
2. Incubar os....

Results

Este protocolo descreve a preparação (Figura 1A-M) e a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha. Este protocolo foi usado com sucesso para a retina a partir de explantes de embriões inteiros de ST20 (E3) para ST31 (E7).

Eletroporação de plasmídeos de DNA em explantes de retina inteiras permite a rotulagem e rastreamento de células progenitoras da retina ou a sobre-expressão de diferentes produtos de genes. Para as experiências de electroporação.......

Discussion

Neste trabalho, um protocolo detalhado para dissecção, eletroporação ou tratamento químico, e cultivo de explantes de retina inteiras de embriões de galinha é apresentado. Este protocolo é fácil, rápido e permite tanto uma elevada taxa de sucesso e reprodutível resultados.

A electroporação de explantes de retina inteiros produz grandes áreas de células que expressam a construção de gene de interesse. É fácil de posicionar correctamente os eléctrodos e para expor uma porção.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
Placa de Petri de 100 mm	VWR	734-0006
100 μ l ponteiras de pipeta	VWR	613-0798
Cubeta de plástico descartável de 1,5 ml	Thomas Scientific	8495V01
Placa de 24 poços	Sigma Aldrich	D7039
Placa de Petri de 35 mm	VWR	391-1998
70% etanol	Solveco	1054
Inibidor de Cdk1/2 III	217714	Calbiochem	300 nM em 0,01%
Incubadora de cultura de células	Thermo Forma
Microscópio de dissecação	Leica
	DMEM Life Technologies	41966-029
Eletrodos
eletro porator quadrado feito sob medida ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Fórceps	AgnThos	0108-5-PS
Meio de congelamento NEG50	Cellab, Suécia	6502
GFP expressando plasmídeo de DNA (pZGs)
Incubadora umidificada	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Alemanha	8204
Insulina	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamina	Life Technologies	25030024
Meio de montagem ProLong Gold com DAPI	Life Technologies	P36935
Filme de parafina	VWR	291-1214P
Paraformaldeído	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Molde de embutir Peel-A-Way	Sigma Aldrich	E6032
Penicilina estreptomicina	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Diluição 1/4,000
Eletrodos de platina (feitos sob medida a partir de "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, espessura de 0,1 mm
Eletrodos Platimun	Sonidel	CUY700P4L	Diâmetro: 4 mm
Pipeta de pasteur de polietileno	VWR	612-2853
Agitador rotativo	VWR	444-2900
Colher pequena	VWR	231-2151
Sacarose	VWR	443815S
Ovos Leghorn brancos Fornecedor			local
Refrigerador de vinho	WineMaster 24, Caso, Berlim, Alemanha