Hela Retinala Explantat från kycklingembryon för elektroporering och kemiskt reagens Behandlingar
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att dissekera, experimentellt manipulera och kultur hela näthinnan explants från kycklingembryon. Explantation kulturer är användbara när hög träffsäkerhet, effektivitet och reproducerbarhet krävs för att testa effekterna av plasmider för elektroporering och / eller reagensämnen, dvs enzymatiska hämmare.
Abstract
Näthinnan är en bra modell för det utvecklande centrala nervsystemet. Den stora storleken av ögat och framför allt tillgängligheten för experimentella manipulationer i ovo / in vivo gör kycklingen embryonala näthinnan en mångsidig och mycket effektiv experimentell modell. Även kyckling näthinnan är lätt att rikta in ovo genom intraokulära injektioner eller elektroporation, kan den effektiva och exakta koncentrationen av reagensen i näthinnan vara svårt att helt kontroll. Detta kan bero på variationer i den exakta injektionsstället, läckage från ögat eller ojämn diffusion av substanser. Vidare är frekvensen av missbildningar och mortalitet efter invasiva manipulationer såsom elektroporation ganska hög.
Detta protokoll beskriver pt ex ovo teknik för odling hela näthinnan explants från kycklingembryon och tillhandahåller en metod för kontrollerad exponering av näthinnan till reagens. Protocol beskriver hur att dissekera, experimentellt manipulera och kultur hela näthinnan explants från kycklingembryon. Explantaten kan odlas cirka 24 timmar och utsättas för olika manipulationer såsom elektroporering. De stora fördelarna är att experimentet inte är beroende på överlevnaden av embryot och att koncentrationen av den införda reagenset kan varieras och kontrolleras för att fastställa och optimera den effektiva koncentrationen. Dessutom är den teknik snabb, billig och tillsammans med dess höga experimentella framgång, garanterar det reproducerbar resultat. Det bör understrykas att det fungerar som ett utmärkt komplement till experiment utförda in ovo.
Introduction
Näthinnan är en del av det centrala nervsystemet och det är, med sin relativa enkelhet och väldefinierad cellulär arkitektur, en populär modell för att studera centrala utveckling nervsystemet. Ögat hos kycklingembryo är relativt stor i jämförelse med resten av embryot. Det är därför lätt att nå in ovo för experimentella manipulationer, såsom injektioner eller elektroporering, och fungerar som ett utmärkt verktyg för att få kunskap om retinal cell och utvecklingsbiologi in vivo. Trots dessa stora fördelar, kan överlevnad embryon vara låg när experiment är invasiva såsom med electroporations, upprepade injektioner, eller kombinerade experimentella manipulationer.
Elektroporering av DNA-plasmider in i kycklingembryo in ovo är ett viktigt och väl etablerad teknik 1. Det möjliggör märkning av nervceller, spårning av cell öde liksom neuronala områden i centrala nervligt systemet och den möjliggör ektopisk genuttryck för att analysera proteinfunktion in vivo. Tekniken har använts för studier av neuralrörsdefekter 2, bakhjäman 3, och näthinnan 4. Elektroporering av embryonala näthinnan i ovo har vissa experimentella svårigheter som är relaterade till de vivo situationen. Positionen för ögat, på grund av den kraniella vikning av embryot, är relativt nära hjärtat. Denna närhet ökar risken för hjärtstillestånd efter elektroporering och risken ökar med åldern av embryot. Dessutom är det att komma åt ögat nödvändigt att öppna de embryonala membranen, vilket ökar risken för blödning, missbildningar och efterföljande minskad lönsamhet. Vid testning och optimering av en ny DNA-plasmid ofta utan känd fenotypisk resultat, kan dessa begränsningar minska effekten och kraften i metoden även för en erfaren experimentalist. Som framgår av detta protokoll, kultur whål retinal explantat, definierad som hela neurala näthinnan med pigmentepitelet avlägsnats, är en effektiv metod som kompletterar in ovo-tillvägagångssätt.
Intraokulära injektioner av kemiska reagens är relativt lätta att utföra in ovo. Dock kan den effektiva och exakta koncentrationen av injicerade reagenser i den neurala näthinnan vara svårt att helt kontrollera. Den injicerade volymen kan variera på grund av läckage och det exakta injektionsstället kan påverka såväl fördelningen av reagenset inuti ögat och diffusion genom glaskroppen. Variationen kommer att få stora konsekvenser för tolkning av resultaten när det vill säga en dos-responskurva för ett enzymhämmare bestäms; särskilt om effekten är liten och den temporala fönstret av effekten är smal. Dessutom kan bara en enda öga användas från varje embryo när du utför i ovo experiment på grund av potentiella systemiska effekter via blodetpå den kontralaterala ögat. Ålder matchning är viktigt när man studerar utvecklingen och den individuella variationen mellan behandlade och embryon kontroll kan leda till ytterligare experimentell variabilitet.
Av dessa skäl var en ex ovo metod baserad på näthinnan explants från kycklingembryon utvecklas, där neurala näthinnan kan utsättas för en enhetlig och kontrollerad experimentell tillstånd in vitro. Den nuvarande protokollet har utvecklats baserat på tidigare protokollen 5-9. Retinala explants från scenen (st) 20 (embryonala dagar [E] 3) till ST31 (E7) kycklingembryon dissekerades, odlades och elektro med en definierad DNA-plasmid koncentration eller utsätts för ett medium innehållande en definierad koncentration av ett kemiskt reagens. Protokollet presenteras här har framgångsrikt genomförts under de senaste publikationer, med hjälp av flera olika kemiska reagenser, inklusive regulatorer av DNA-skador väg, såsom KU55933, SB 218078 och NSC 109555 ditosylate och cellcykeln, såsom CDK1 / 2-hämmare III 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete ett detaljerat protokoll för dissektion, elektroporering eller kemisk behandling, och odling av hela näthinnan explants från kycklingembryon presenteras. Detta protokoll är lätt, snabbt och möjliggör både ett bra resultat och reproducerbara resultat.
Elektroporering av hela näthinnan explants producerar stora områden av celler som uttrycker genkonstruktionen av intresse. Det är lätt att korrekt positionera elektroderna och för att exponera en sp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
