Elektroporasyon ve Kimyasal Reaktif tedaviler için Tavuk Embriyolar gelen bütün Retina Eksplantlarındaki
Summary
Bu protokol, teşrih deneysel işlemek ve tavuk embriyo kültür bütün retinal eksplantlar için bir yöntem tarif eder. Yüksek başarı oranı, etkinlik ve tekrarlanabilirlik elektroporasyon ve / veya reaktif maddelerin, örneğin, enzimatik inhibitörleri için plasmidlerin etkilerini test etmek için gerekli olduğunda eksplant kültürleri yararlıdır.
Abstract
Retina gelişen santral sinir sistemi için iyi bir modeldir. Ovo / in vivo deneysel manipülasyonlar için gözün büyük boy ve en önemlisi erişilebilirlik tavuk embriyonik retina çok yönlü ve çok verimli deneysel bir model yapar. Tavuk retina göz içi enjeksiyonlar veya elektroporasyon ile ovo hedef kolay olmasına rağmen, retinada reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol edilmesi zor olabilir. Bu göz veya maddelerin dengesiz difüzyon tam enjeksiyon yerinde, kaçak varyasyonları nedeniyle olabilir. Ayrıca, bu tür elektroporasyon gibi invaziv manipülasyonlara sonra malformasyonlar ve ölüm sıklığı oldukça yüksektir.
Bu protokol, tavuk embriyolarından bütün retinal eksplantlar kültürlenmesi için tekniğin ovo bir eski açıklar ve reaktifler retinanın kontrol maruz için bir yöntem sağlar. Protocol deneysel, incelemek işlemek ve tavuk embriyoları kültür bütün retina eksplantlar açıklamaktadır. Eksplantlar, yaklaşık 24 saat boyunca kültüre edilebilir ve elektroporasyon gibi farklı manipülasyonlara tabi. Önemli avantajları Deney embriyo hayatta kalma ve katılan reaktif maddenin konsantrasyonu değişebilir ve etkili konsantrasyonunu tespit etmek ve optimize etmek için kontrol edilebilir bağımlı değildir vardır. Ayrıca, teknik, yüksek deneysel bir başarı oranı ile birlikte, hızlı, ucuz ve, bu tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar. O ovo yapılan deneyler için mükemmel bir tamamlayıcı olarak hizmet ettiği vurgulanmalıdır.
Introduction
Retina, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır ve göreli olarak basit ve iyi karakterize edilmiş hücre mimarisi, merkezi sinir sistemi gelişme eğitim için uygun bir model ile, bir. Tavuk embriyo göz embriyo geri kalanına kıyasla nispeten büyüktür. Bu nedenle bu tür enjeksiyonlar veya elektroporasyon gibi deneysel manipülasyonlar için ovo kolayca erişilebilir ve retina hücre ve in vivo gelişimsel biyoloji hakkında bilgi sahibi için mükemmel bir araç olarak hizmet vermektedir. Deneyler elektroporasyon, tekrar enjeksiyonları ya da kombine deneysel manipülasyonlar ile olduğu gibi invazif zaman bu büyük avantajlara rağmen, embriyoların sağkalım düşük olabilir.
Ovo tavuk embriyo DNA plazmid Elektroporasyon önemli ve iyi bilinen bir tekniktir 1'dir. Bu merkezi nerv hücre kaderinin yanı sıra nöronal yolları izleme, nöronların etiketlenmesi için izin verirlı sistemi ve in vivo proteinin fonksiyonunu analiz etmek için ektopik gen ifadesi için izin verir. Tekniğin 3 arka beyin ve 4 retina, nöral tüp 2 çalışmaları için kullanılmıştır. Ovo embriyonik retinanın Elektroporasyon in vivo durumla ilgili bazı deneysel zorlukları vardır. Embriyonun kranyal katlama nedeniyle göz konumu, kalpten nispeten yakındır. Bu yakınlık elektroporasyon aşağıdaki kardiyak arrest riskini ve embriyonun yaşla birlikte riski de artmaktadır. Ayrıca, göz erişmek için, bu suretle kanama, malformasyonlar ve sonraki azaltılmış canlılığı riskini artırarak, embriyonik zarlar açmak için gereklidir. Test ve bilinen bir fenotipik sonuç olmadan sık sık yeni bir DNA plazmid optimize ederken, bu sınırlamalar bile deneyimli bir deneye ilişkin yöntemin etkinliğini ve gücünü azaltabilir. Bu protokol, w kültüründe görüldüğü gibikaldırıldı pigment epiteli ile tüm nöral retina olarak tanımlanan deliğin retina eksplant, ovo yaklaşımda tamamlar verimli bir yöntemdir.
Kimyasal reaktifler Göz içi enjeksiyonları ovo gerçekleştirmek için göreceli olarak kolaydır. Ancak, sinir retinada enjekte reaktiflerin etkili ve tam konsantrasyonu, tam olarak kontrol etmek zor olabilir. Enjekte edilen hacim kaçak nedeniyle değişebilir ve enjeksiyon tam site gözün içindeki reaktif dağılımı ve vitreus yoluyla yayılmasını hem de etkileyebilir. Değişkenlik, yani bir enzim inhibitörü bir doz-yanıt eğrisi belirlenir sonuçların yorumlanması için önemli etkileri olacaktır; etkisi küçük ve etkisi zamansal pencere dar özellikle. Ovo deneylerde yaparken Üstelik, yalnızca tek göz, kan akışı yoluyla sistemik potansiyel etkilerine her embriyo kullanılabilirkontralateral gözün üzerine. Geliştirilmesi ve tedavi ve kontrol embriyolar ek deneysel değişkenliği yol açabilir arasındaki bireysel değişkenliği çalışılırken yaş eşleştirme önemlidir.
Bu nedenlerden dolayı, tavuk embriyolarından retina eksplantlar göre yöntem ovo eski bir nöral retinanın tekbiçimli maruz kalabilir ve in vitro deney koşullarını kontrol geliştirilmiştir. Mevcut protokol önceki protokollere 5-9 dayanarak geliştirilmiştir. Aşamasından Retina eksplantlar (st) st31 20 (3, embriyonik gün [E]) (E7) tavuk embriyoları kültürlendi, parçalara ayrıldı ve elektroporasyona tanımlanmış bir DNA plazmid konsantrasyonu veya bir kimyasal madde belirli bir konsantrasyonunu içeren bir ortama maruz bırakıldı. Burada sunulan protokol başarılı şekilde KU55933, SB 218078 ve NSC 109555 dito gibi DNA hasar yolağının regülatörleri de dahil olmak üzere, pek çok farklı kimyasal reaktif maddeler kullanılarak son yayınlarda uygulanmıştırBöyle CDK1 / 2 inhibitörü III 10,11 olarak mesilattır ve hücre döngüsü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada diseksiyon, elektroporasyon veya kimyasal arıtma ve tavuk embriyoları tüm retina eksplant kültür için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, hızlı, kolay ve hem de yüksek bir başarı oranı ve tekrarlanabilir sağlar Sonuçlar.
Bütün retina eksplantlar Elektroporasyon söz konusu gen yapısını eksprese eden hücrelerin büyük bir kısmını oluşturur. Bu doğru elektrotları konumlandırmak için ve tanımlanmış bir DNA plazm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
Referências
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
