FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
Hücre içi tau amiloid birikimi, Alzheimer hastalığı gibi tauopatıler tanımlar. Hastalığın erken evrelerinde, patoloji genellikle beynin farklı bölgelerinde lokalize, ancak hastalığın ilerlemesi ile, patoloji kaçınılmaz farklı sinir ağları 1-5 boyunca yayılır. Biriken deliller toksik protein agrega transselüler yayılımı (6-10 gözden) Bu patoloji altında yatan göstermektedir. Bu modelde, proteopathic tohumları (örneğin, tau) verici hücrelerden salınan ve şablonu konformasyonal değişiklik 11-15 ile yanlış katlanmış formda doğal tau proteini dönüşürken, komşu hücreleri girin. Burada açıklanan tahlil hassas tür tohum aktivitesini tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu rekombinant proteinin ve biyolojik numuneler ile uyumlu ve proteopathic tohumlama aktivitesi 16 dakikalık seviyelerinin ölçümü sağlar.
Stabil tau tekrar d ifade HEK 293T hücreleriCFP ya YFP da kaynaşmış hastalıkla ilişkili P301S mutasyonu içeren OMain (RD) tohumlama aktivitesi stabil biyosensör olarak hizmet (bundan sonra tau-RD-CFP / YFP hücreleri olarak da adlandırılır). Proteopathic tohum yokluğunda, hücreler, bir çözünür bir monomer olarak tau korumak ve kayda değer bir plan FRET sahiptir. Hücrelerin içine spontan alma ya da tau tohumların lipozom-aracılı iletim Bununla birlikte, akış sitometrisi ile, tek hücreler içinde ölçüldüğü bir FRET sinyali üretir RD-CFP ve RD-YFP agregasyonu ile sonuçlanır.
Bu testte çok sayıda bileşenleri duyarlılığını artırmak ve değişkenliği azaltmak için geliştirilmişti. Bir 1 monoklonal hücre çizgisi: en uygun sinyal sağlar olarak 1 RD-CFP / YFP sentezleme oranı seçildi: gürültü. Hassasiyetini artırmak için, fosfolipidler, doğrudan hücre içine tohum tanıtmak için kullanılan (uptake biyolojik mekanizmaları incelemek için, ancak bu ihmal edilebilir). Son olarak, nüfus düzeyi ve tek bir hücre de izler FRET akım sitometri seviye, diğer protein kümeleme deneyleri aksine. Nihai sonuç ölçüsü, entegre FRET yoğunluğu, yüksek kantitatif ve agregasyonu ile hücrelerin sayısında ve kümeleme her hücrede meydana geldi hangi derecede hem hesapları. Bu optimize tüm parametreler duyarlılığını artırmak ve tekrarlanabilirlik sağlamak.
Bu sistem son zamanlarda yaygın olarak kullanılan diğer tau patolojik belirteçleri temporal başlamasını ve tau tohumlama faaliyetleri göreli ilerlemesini (örneğin, MC1, AT8, PG5 ve ThioflavinS) değerlendirildi transgenik P301S tauopathy farelerde 17 kapsamlı bir çalışmada kullanılmıştır. Tohum etkinlik bugüne kadar en az 6 hafta histolojik algılama önceki değerlendirilen tau patolojisi en eski ve en güçlü işaret vardır. Tohum aktivite başlangıcı ve / veya nörodejenerasyonda 16 ilerlemesinde proteopathic tohumların nedensel rolünü düşündürmektedir 1.5 ay ve ilerleyen yaşla birlikte artar görünür.
e_content "> biyolojik örneklerden tohum malzemesi dakika seviyelerinin hassas kantitatif. Erken hastalığın ilerlemesini izlemek çalışmaları kolaylaştırabilir deneme süresinin kısaltılması ve genç hayvanların kullanılmasını sağlayarak, bu klinik öncesi hayvan deneylerinde verimliliği ve doğruluğunu artırabilir. Örneğin, P301S fare daha önce tarif edilen, kurşun bileşikleri erken 4-6 hafta kadar teslim edilebilir, ve 2-4 hafta sonra etki için izlenir. deney doğru tohumlama herhangi bir azalma ölçmek gerekir (ya da ekim aktivitesi başlangıcında hemen önce) faaliyet. sitometrisi in vitro tarama uygulamaları da. Örneğin, anti-tau reaktifler (örneğin, antikorlar, küçük moleküller, vs.) ya da rekombinant tau kullanılarak yapılmış, kültür doğrudan indüksiyon tohumlama bloke etme kapasitesi hızlı bir şekilde test edilebilir olan akış FRET bir tohum kaynağı (Şekil 5). Bu düzenleme ile, tohum malzemesi hazırlandıktan sonra, eski olarak agrega ya da beyin türevli lisatlarperiment veri analizi de dahil olmak üzere, tamamlamak için sadece üç gün sürer. Proteopathic tohumlama faaliyetinin hızla kantitatif böylece nörodejenerasyon birçok çalışma kolaylaştırabilir.Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan FRET akım sitometri sistemi hızlı ve kantitatif tau tohumlama aktivitesini değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Sadece orta hücre kültürü deneyim ve FRET çalışan bir bilgi ve akım sitometri gerektirir. Beta bilanço yapısı bağlandığı zaman floresan gelişmiş sergileyen – – örneğin Thioflavin T gibi diğer ekim deneyleri, zahmetli ve saf, rekombinant protein alt tabakayı gerektirir. Ayrıca, tau için in vitro tohumlama deneyleri sadece semi-kantitatif ve tohum mal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
Referências
- Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks. Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).
- Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome. Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).
- Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia. Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Braak, H., Braak, E. Staging of Alzheimer’s disease-related neurofibrillary changes. Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).
- Frost, B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Cellular mechanisms of protein aggregate propagation. Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).
- Kaufman, S. K., Diamond, M. I. Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies. Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).
- Holmes, B. B., Diamond, M. I. Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target. J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases. Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).
- Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
- Guo, J. L., Lee, V. M. Y. Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles. Journal of Biological Chemistry. , (2011).
- Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).
- de Calignon, A., et al. Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer’s Disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
- Liu, L., et al. Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo. PLoS One. 7 (2), e31302 (2012).
- Holmes, B. B., et al. Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 .
- Yoshiyama, Y., et al. Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model. Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65 (65), (2012).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse. J Vis Exp. (33), (2009).
- Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies. Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).
- McDonnell, G., et al. Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination. J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).
- Banning, C., et al. A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells. PLoS One. 5 (2), e9344 (2010).
- Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer’s Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein. Bioquímica. , (2013).
- Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein. J Vis Exp. (95), e51537 (2015).
