Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Jennifer L. Furman; Brandon B. Holmes; Marc I. Diamond

doi:10.3791/53205

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Artigo de método

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

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DOI:

10.3791/53205

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8 de dezembro de 2015

Jennifer L. Furman^*¹ , Brandon B. Holmes^*¹ , Marc I. Diamond¹

¹Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A transferência de célula para célula de agregados proteicos, ou sementes proteopáticas, pode estar subjacente à progressão da patologia em doenças neurodegenerativas. Aqui, é descrito um novo ensaio de citometria de fluxo FRET que permite a detecção específica e sensível da atividade de semeadura de amostras recombinantes ou biológicas.

Resumo

Evidências crescentes apóiam a propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas, ou sementes proteopáticas, como um mecanismo para o início e progressão da patologia em várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e as tauopatias relacionadas. O papel potencialmente crítico das sementes de tau na progressão da doença apóia fortemente a necessidade de um ensaio sensível que detecte prontamente a atividade de semeadura em amostras biológicas.

Ao combinar a especificidade da transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a sensibilidade da citometria de fluxo e a estabilidade de uma linhagem celular monoclonal, um ensaio de semeadura ultrassensível foi projetado e é compatível com a detecção de sementes de amostras recombinantes ou biológicas, incluindo homogeneizados cerebrais humanos e de camundongos. O ensaio emprega células monoclonais HEK 293T que expressam de forma estável o domínio repetido (RD) propenso à agregação de tau que abriga a mutação P301S associada à doença fundida a CFP ou YFP, que produzem um sinal FRET na agregação de proteínas. A absorção de sementes proteopáticas de tau (mas não de outras proteínas) nas células biossensoras estimula a agregação de RD-CFP e RD-YFP, e a citometria de fluxo monitora sensível e quantitativamente esse FRET induzido por agregação. O ensaio detecta concentrações femtomolares (equivalente a monômero) de sementes de tau recombinantes, tem uma faixa dinâmica que abrange três ordens de magnitude e é compatível com homogeneizados cerebrais de camundongos transgênicos de tauopatia e indivíduos de tauopatia humana. Com pequenas modificações, o ensaio também pode detectar a atividade de semeadura de outras sementes proteopáticas, como a α-sinucleína, e também é compatível com culturas neuronais primárias. A facilidade, sensibilidade e ampla aplicabilidade da citometria de fluxo FRET tornam útil estudar uma ampla gama de distúrbios de agregação de proteínas.

Introdução

A acumulação intracelular de tau amilóides define tauopatias, tais como a doença de Alzheimer. Nas fases iniciais da doença, patologia está geralmente localizada em regiões discretas do cérebro, mas com a progressão da doença, patologia invariavelmente se espalha ao longo de redes neuronais distintas ^1-5. Evidências sugerem propagação transcelular de agregados de proteínas tóxicas subjacente a esta patologia (revisto em ^10/06). Neste modelo, sementes proteopathic (por exemplo, tau) são libertados a partir de células do doador e entrar nas células vizinhas, transformando proteína tau nativo na forma mal dobrada através modelada alteração....