Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
تراكم داخل الخلايا تاو amyloids يعرف tauopathies مثل مرض الزهايمر. في مراحل المرض المبكرة، يتم ترجمة الأمراض عموما إلى مناطق منفصلة من الدماغ، ولكن مع تطور المرض، والأمراض ينتشر دائما على طول الشبكات العصبية متميزة 1-5. وتشير الأدلة المتراكمة الانتشار العابر للمن المجاميع البروتين السامة راء هذه الأمراض (إعادة النظر في 10/6). في هذا النموذج، يتم الافراج بذور proteopathic (على سبيل المثال، تاو) من الخلايا المانحة، وتدخل الخلايا المجاورة، وتحويل البروتين تاو الأصلي في شكل تتجمع عبر قالب تغيير متعلق بتكوين 11-15. وقد تم تطوير هذا الفحص الموصوفة هنا للكشف عن حساسية هذا النشاط البذر. وهو متوافق مع المؤتلف البروتين والعينات البيولوجية وتمكن الكمي لمستويات دقيقة من النشاط البذر proteopathic 16.
خلايا كلوة 293T التي تعبر عن ثابت تاو تكرار دomain (RD) التي تحتوي على طفرة P301S الأمراض المرتبطة تنصهر فيها إما CFP أو YFP (يشار إليها فيما يلي باسم خلايا تاو-RD-CFP / YFP) بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي مستقر من النشاط البذر. في غياب البذور proteopathic، الخلايا تحافظ تاو كما مونومر القابلة للذوبان، وليس لها أي الحنق خلفية ملموس. امتصاص عفوية أو بوساطة الحويصلية تنبيغ من بذور تاو في الخلايا، ولكن النتائج في RD-CFP وRD-YFP التجميع، التي تنتج إشارة الحنق أن يقاس داخل الخلايا واحدة عن طريق التدفق الخلوي.
تم هندستها مكونات عديدة من هذا الاختبار لتعزيز الحساسية والحد من التقلبات. وقد تم اختيار 1 RD-CFP / YFP نسبة التعبير، كما أنه يوفر إشارة الأمثل:: خط خلية وحيدة النسيلة مع 1 الضوضاء. لزيادة حساسية، وتستخدم الدهون الفوسفاتية لتقديم البذور مباشرة في الخلايا (على الرغم من أن دراسة الآليات البيولوجية للامتصاص، وهذا يمكن أن يتم حذف). وأخيرا، التدفق الخلوي المراقبين الحنق على مستوى السكان وخلية واحدة مستوى، خلافا لغيرها من فحوصات البروتين التجميع. وقياس النتيجة النهائية، والكثافة الحنق متكاملة، كمي للغاية ويمثل على حد سواء لعدد من الخلايا مع التجميع، والدرجة التي حدث التجميع داخل كل خلية. كل هذه المعلمات الأمثل تعزيز حساسية وضمان التكاثر.
كان يعمل هذا النظام مؤخرا في دراسة شاملة في المعدلة وراثيا P301S الفئران tauopathy 17 التي قيمت بداية الزمني وتطور تاو النشاط البذر نسبة إلى أخرى تاو تستخدم عادة علامات مرضية (على سبيل المثال، MC1، AT8، PG5، وThioflavinS). النشاط البذر هو إلى حد بعيد أقرب وأقوى علامة من تاو أمراض تقييمها، وذلك قبل الكشف النسيجي بنسبة 6 أسابيع على الأقل. يبدو النشاط البذر في 1.5 شهر ويزيد تدريجيا مع التقدم في السن، مما يشير إلى دور المسببة للبذور proteopathic في بداية و / أو تقدم من التنكس العصبي 16.
e_content "> الكميات الدقيقة لمستويات دقيقة من المواد البذور من العينات البيولوجية يمكن أن تسهل الدراسات التي ترصد تطور المرض في وقت مبكر. بتقصير مدة المحاكمة وتمكين استخدام الحيوانات الأصغر سنا، وهذا يمكن أن يزيد من كفاءة ودقة التجارب على الحيوانات قبل السريرية. على سبيل المثال، في وP301S الماوس سبق وصفها، يمكن أن يتم تسليم مركبات الرصاص في وقت مبكر من 4-6 أسابيع (مباشرة قبل أو في بداية النشاط البذر)، ورصدت لفعالية 2-4 أسابيع في وقت لاحق. الفحص يجب تحديد بدقة أي تخفيضات في البذر النشاط. الحنق التدفق الخلوي ويمكن اختبارها في المختبر فحص التطبيقات كذلك. على سبيل المثال، الكواشف مكافحة تاو (على سبيل المثال، والأجسام المضادة، والجزيئات الصغيرة، وغيرها) بسرعة لقدرتها على منع البذر تحريض مباشرة في الثقافة، وذلك باستخدام إما تاو المؤتلف المجاميع أو لست] المستمدة من الدماغ كمصدر البذور (الشكل 5). مع هذا الإعداد، بعد الانتهاء من إعداد المواد البذور، وهو رئيس سابقملصقة يأخذ ثلاثة أيام فقط لإكمال، بما في ذلك تحليل البيانات. وبالتالي يمكن تحديد الكميات السريع النشاط البذر proteopathic تسهيل العديد من الدراسات من التنكس العصبي.الحنق التدفق الخلوي النظام المذكور هنا هو أداة قوية لبسرعة وكميا تقييم النشاط تاو البذر. لا يتطلب سوى المعتدلة تجربة زراعة الخلايا ومعرفة عمل من الحنق والتدفق الخلوي. المقايسات البذر الأخرى، مثل Thioflavin T – الذي يسلك تعزيز مضان عندما يتجهون إلى هيكل رقة بيتا – هي شاقة وت…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
TBS | Sigma | T5912 |
cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |