Détection sensible de Proteopathic semis Activité FRET avec la cytométrie en flux
Summary
Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.
Abstract
Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples.
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as α-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.
Introduction
L'accumulation intracellulaire de la protéine tau amyloïdes tauopathies définit comme la maladie d'Alzheimer. Dans les stades précoces de la maladie, la pathologie est généralement localisée à des régions discrètes du cerveau, mais avec la progression de la maladie, la pathologie se propage le long de invariablement réseaux neuronaux distincts 1-5. L'accumulation de preuves suggère transcellulaire propagation d'agrégats de protéines toxiques à la base de cette pathologie (revue dans 10/06). Dans ce modèle, les graines proteopathic (par exemple, tau) sont libérés de cellules du donneur et pénètrent dans les cellules voisines, la transformation de la protéine tau natif dans le formulaire mal repliées via templated changement conformationnel 11-15. L'essai décrit ici a été développé pour détecter sensibilité telle activité d'ensemencement. Il est compatible avec la protéine recombinante et des échantillons biologiques et permet la quantification des niveaux d'activité minute d'ensemencement proteopathic 16.
Des cellules HEK 293T qui expriment de manière stable la protéine tau répétition dOMAINE (RD) contenant le P301S mutation associée à la maladie soit fusionnée à PCP ou YFP (ci-après dénommé cellules tau-RD-CFP / YFP) servir un biocapteur stable de l'activité d'ensemencement. En l'absence de graines proteopathic, maintenir les cellules tau en tant que monomère soluble, pas de fond et ont FRET appréciable. L'absorption spontanée ou transduction médiée par des liposomes de graines de tau dans les cellules, cependant, conduit à RD-CFP et YFP-agrégation RD, qui produit un signal de FRET qui est mesurée dans des cellules individuelles par cytométrie en flux.
De nombreux composants de cet essai ont été conçus pour améliorer la sensibilité et de réduire la variabilité. Une lignée cellulaire monoclonal avec un 1: RD-CFP / YFP 1 ratio d'expression a été choisi, car il fournit un signal optimal: le bruit. Pour augmenter la sensibilité, les phospholipides sont utilisés pour introduire les graines directement dans les cellules (bien que d'étudier les mécanismes biologiques de l'absorption, cela peut être omise). Enfin, la cytométrie de flux moniteurs FRET au niveau de la population et une seule cellule niveau, contrairement à d'autres essais d'agrégation des protéines. Le critère d'évaluation finale, la densité de FRET intégré, est hautement quantitative et représente à la fois pour le nombre de cellules présentant l'agrégation, et la mesure dans laquelle l'agrégation a eu lieu au sein de chaque cellule. Tous ces paramètres optimisés améliorer la sensibilité et de garantir la reproductibilité.
Ce système a été récemment utilisé dans une étude approfondie dans les souris transgéniques tauopathie P301S 17 qui a évalué l'apparition temporelle et la progression de l'activité d'ensemencement de tau par rapport à d'autres marqueurs pathologiques de la protéine tau couramment utilisés (par exemple, MC1, AT8, PG5, et thioflavines). L'activité de semis est de loin le marqueur précoce et le plus robuste de la pathologie tau évalué, précédant la détection histologique par au moins 6 semaines. Semis activité apparaît à 1,5 mois et augmente progressivement avec l'âge, ce qui suggère un rôle causal de graines proteopathic dans l'apparition et / ou la progression de la neurodégénérescence 16.
e_content "> quantification précise des niveaux infimes de matériel de semence à partir d'échantillons biologiques peut faciliter les études qui surveillent la progression de la maladie au stade précoce. En raccourcissant la durée du procès et permettant l'utilisation d'animaux plus jeunes, ce qui pourrait accroître l'efficacité et la précision des essais précliniques animales. Par exemple, dans P301S la souris décrit ci-dessus, les composés du plomb peuvent être fournis aussi tôt que 4-6 semaines (juste avant, ou au début de l'activité d'ensemencement), et pour surveiller l'efficacité 2-4 semaines plus tard. Le dosage devrait quantifier avec précision toute réduction des semis activité. FRET cytométrie en flux a in vitro applications de criblage ainsi. Par exemple, des réactifs anti-tau (par exemple, des anticorps, de petites molécules, etc.) peut être testé rapidement pour leur capacité à bloquer l'ensemencement induction directement dans la culture, en utilisant soit la protéine tau recombinante agrégats ou lysats dérivé du cerveau comme une source de graines (figure 5). Avec cette configuration, une fois matériel de semence est préparé, un exexpé- prend seulement trois jours pour compléter, y compris l'analyse de données. La quantification rapide de l'activité d'ensemencement proteopathic peut donc faciliter de nombreuses études de la neurodégénérescence.Protocol
Representative Results
Discussion
La cytométrie en flux système de FRET décrit ici est un outil puissant pour évaluer rapidement et quantitativement l'activité de la protéine tau ensemencement. Elle exige seulement une expérience de culture cellulaire modérée et une connaissance pratique de FRET et cytométrie de flux. D'autres essais de semis, comme Thioflavine T – qui présente une fluorescence améliorée lorsqu'il est lié à la structure de feuillet bêta – sont laborieux et nécessitent un substrat de protéine pure, recombina…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), a Department of Defense Grant PT110816 (to M.I.D.), 1F32NS087805 (to J.L.F.), and 1F31NS079039 (to B.B.H.).
Materials
| TBS | Sigma | T5912 |
| cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free) | Roche | 4693159001 |
| Cryo-vials | Sarstedt | 72.694.006 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | XSE 105DU |
| Weighing Boats | Fisher Scientific | 13-735-743 |
| 15 mL conical tube | USA Scientific | 1475-0501 |
| Omni Sonic Ruptor Ultrasonic Homogenizer | Omni International | 18-000-115 |
| Micro-Tip for Ultrasonic Homogenizer | Omni International | OR-T-156 |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A451 |
| Noise Cancelling Ear Muffs | Fisher Scientific | 19-145-412 |
| Kimwipes | Fisher Scientific | S47299 |
| 1.5 mL tubes | USA Scientific | 1615-5510 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 000.215 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-136 |
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| 50 mL Conical Tubes | Phenix Research | SS-PH15 |
| 25 mL reagent resevoirs | VWR | 41428-954 |
| Multi channel pipet | Fisher Scientific | TI13-690-049 |
| 96 well flat bottom plates | Corning | 3603 |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 96 well round bottom plates | Corning | 3788 |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED2SS |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 |
| Sorvall ST 40 Centrifuge | Thermo Scientific | 75004509 |
| BIOLiner Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003796 |
| Hemacytometer | VWR | 15170-172 |
| MACSQuant VYB Flow Cytomter | Miltenyi Biotec | 130-096-116 |
| Chill 96 Rack | Miltenyi Biotec | 130-094-459 |
| Flow Jo analysis software | Flow Jo | |
| 20 uL pipet tips | Rainin | GPS-L10 |
| 200 uL pipet tips | Rainin | GPS-250 |
| 1 mL pipet tips | Rainin | GPS-1000 |
| 200 uL pipet tips | USA Scientific | 1111-1800 |
| 5 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-606180 |
| 10 mL serological pipett | Phenix Research | SPG-607180 |
| 25 mL Serological pipett | Phenix Research | SPG-760180 |
Referências
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