Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Myokardieinfarkt (MI) har dramatiske mellem- og langsigtede konsekvenser på de fysiologiske og adfærdsmæssige niveauer, men de involverede mekanismer er stadig uklart. Vores laboratorium har udviklet en rotte model af post-MI syndrom, der viser nedsat hjertefunktion, neurontab i det limbiske system, kognitive underskud og adfærdsmæssige tegn på depression. På den neuronale niveau, caspase-3 aktivering medierer post-MI apoptose i forskellige limbiske regioner, såsom amygdala – toppede på 3 dage efter MI. Kognitive og adfærdsmæssige svækkelser vises 2-3 uger efter MI og disse korrelerer statistisk med foranstaltninger af caspase-3 aktivitet. Protokollen beskrevet her anvendes til at inducere MI, indsamle amygdala væv og måle caspase-3 aktivitet ved anvendelse af spektrofluorometri. For at inducere MI, er nedadgående kranspulsåre okkluderet i 40 minutter. Protokollen for evaluering af caspase-3-aktivering starter 3 dage efter MI: rotterne aflivet, og amygdala isoleret RapiDLY fra hjernen. Prøver fryses hurtigt i flydende nitrogen og holdt ved -80 ° C indtil selve analysen. Teknikken for at vurdere caspase-3-aktivering er baseret på spaltning af et substrat (DEVD-AMC) ved caspase-3, som frigiver et fluorogent forbindelse, som kan måles ved spektrofluorometri. Metodikken er kvantitativ og reproducerbar, men det nødvendige udstyr er dyrt og proceduren til kvantificering af prøverne er tidskrævende. Denne teknik kan anvendes på andre væv, såsom hjerte og nyre. DEVD-AMC kan erstattes af andre substrater for at måle aktiviteten af andre caspaser.
Caspaser eller cystein-afhængige aspartat-dirigeret proteaser er en familie af enzymer, der er involveret i forskellige homøostase processer, 1. Caspaser kan groft inddeles i henhold til deres roller i apoptose eller betændelse. Caspase-1, -4, -5 og -12 er involveret i inflammation mens dem, der deltager i apoptose kan være sub-klassificeret som initiator caspaser (caspase-8 og -9) og bøddel caspaser (caspase-3, -6 og -7 ).
Caspaser spiller en væsentlig rolle i mange patologiske tilstande, især i lidelser, hvor apoptose kan være for vidtgående, som observeres efter myokardieinfarkt (MI) eller cerebral iskæmi.
I rottemodel for post-MI syndrom anvendes i vores laboratorium, er det fastslået, at caspase-3 aktiveres ikke alene i myocardium 2, men også i det limbiske system, som er impliceret i kontrollen af humør og følelser 3-6. Det ses også, at caspase-3 aktiveres i forskellige regioneraf det limbiske system, såsom amygdala og hippocampus, og denne aktivering toppe omkring 3 dage efter iskæmisk insult 4. Interessant, caspase-3-aktivitet korrelerer med post-MI adfærdsmæssige svækkelser, og dets dæmpning gennem farmakologiske og ernæringsmæssige indgreb reducerer disse skader, hvilket antyder en mulig forbindelse mellem caspase-3 og post-MI depression 7-12.
Caspase-3-aktivering kan måles ved forskellige teknikker. Western blotting konstaterer de enzymatiske egenskaber af caspaser og kan detektere aktive enzymer samt deres proenzym former. Western blotting, er imidlertid semikvantitativ og små variationer kan gå tabt ved svage signal-til-støj-forhold 13. En bedre teknik er baseret på spaltningen af et substrat (DEVD-AMC) ved caspase-3, der frigiver et fluorogent forbindelse og kan måles ved spektrofluorometri. Caspase-3-aktivering er en pålidelig markør for apoptose. Måling af apoptose can være ustabil, fordi den tid vinduet for forekomst er kort, og beslægtede celler kunne phagocytize apoptotiske organer eller celler 14. Apoptose kan yderligere bekræftet af andre teknikker, såsom Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay, der detekterer DNA fragmentering som følge af apoptotiske signalleringskaskader 6, eller forholdet mellem pro- / anti-apoptotiske proteiner, såsom Bax / BCL2 6.
Vores erfaring med denne protokol over de sidste 10 år har ført til identifikation af kritiske metodologiske spørgsmål. Først hurtige hjerne dissektion i en petriskål på knust is er vigtigt at fastholde forberedelse kvalitet. For det andet må det være klart, at væv lydbehandling er kortere for cerebral amygdala i forhold til andre typer af væv, såsom hjertet (10 sek) eller nyrerne (20 SEC). For det tredje bør der udvises stor forsigtighed til omhyggeligt at blande underlaget, før du tilføjer den til prøverne. Vi stødte variable signaler, når blandingsforholdet sekvens var utilstrækkelig. For det fjerde bør ingen bobler være til stede i kvartskuvetter ved læsning prøverne. Ellers kan signalet ændres.
Vi har lavet en ændring i de sidste par år for at øge reproducerbarheden af resultaterne: øget substrat volumen for at undgå volumen mindre end 1 pi. Alligevel kan forekomme små variationer mellem successive analyser, og mindst 3 kontrolprøver bør anvendes tilkontrol for variationer. Fluorescens foranstaltninger af disse kontroller er gennemsnit og gennemsnittet er sat til 100%. Fluorescens foranstaltninger i eksperimentelle prøver omdannes i procent af kontrolprøver.
En anden begrænsning ved teknikken er, at kun en del af væv anvendes, og derfor kunne caspase-3-aktivitet undervurderes. Faktisk er kort i en given celle tidsvinduet af apoptose og kunne blive savnet, selvom det forekommer i tilstødende områder på tidspunktet for prøveudtagning 1,4,15. Det omvendte er også muligt: apoptose kunne være særlig intens i dele af vævet, hvilket resulterer i overestimering af caspase-3-aktivitet. Vi anbefaler brugen af de resterende væv (amygdala) for komplementære teknikker, såsom TUNEL assays eller Bax / Bcl2 forholdet (se indledning).
Spektrofluorometri har mindst to fordele i forhold til Western blotting. For det første gælder genererer kvantitative data. For det andet, den måler enzymatisk enctivity snarere end protein eller RNA-ekspression, der kan være uafhængige, og det vides, at protein-ekspression kan øges uden ændring af enzymatisk aktivitet. Desuden kan spektrofluorometri udføres på andre væv eller med forskellige dyrearter og kan justeres til andre caspase undertyper, med forskellige substrater, således at sikre sammenligninger kan foretages.
Afslutningsvis dette dokument viser anvendelsen af spektrofluorometri at måle caspase-3-aktivitet i amygdala, som godtgør, at apoptose forekommer i denne region i det limbiske system 3 dage efter MI.
The authors have nothing to disclose.
. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada Kim Gilbert besidder en studentship fra Fonds de la recherche du Québec – Santé.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |