We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
I hjernen er de fleste af det vaskulære system består af en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB), der regulerer udvekslingen af molekyler og immunceller mellem hjernen og blodet. Desuden den enorme neuronal metabolisk behov kræver et øjeblik til øjeblik regulering af blodgennemstrømning. Især abnormaliteter af disse regler er ætiologiske kendetegnende for de fleste hjerne patologier; herunder glioblastom, slagtilfælde, ødem, epilepsi, degenerative sygdomme (ex: Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom), hjernetumorer, samt inflammatoriske tilstande, såsom multipel sklerose, meningitis og sepsis-induceret hjernen dysfunktioner. Således at forstå de signaler begivenheder modulerer cerebrovaskulær fysiologi er en stor udfordring. Meget indsigt i de cellulære og molekylære egenskaber af de forskellige celletyper, der udgør cerebrovaskulær systemet kan opnås fra primær kultur eller cellesortering fra frisk dissocierede hjernevæv. Menegenskaber såsom celle polaritet, morfologi og intercellulære relationer vedligeholdes ikke i sådanne præparater. Den protokol, vi beskriver her, er bestemt til at rense hjernen fartøj fragmenter, samtidig med at den strukturelle integritet. Vi viser, at isolerede fartøjer består af endotelceller er forseglet af tight junctions der er omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter, glatte muskelceller samt de perivaskulære astrocyt endfeet membraner forbliver fastgjort til endothellaget. Endelig beskriver vi, hvordan du udfører Immunofarvning eksperimenter på oprensede hjernen fartøjer.
Korrekt funktion af centralnervesystemet (CNS) kræver et stærkt reguleret ekstracellulære miljø, og dens metaboliske krav er store i forhold til andre organer 1. CNS er også yderst følsomme over for en bred vifte af kemikalier, normalt uskadelige for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For at sikre korrekt funktion, det meste af CNS 'vaskulatur danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som styrer strømmen af molekyler og ioner samt passage af immunceller mellem blodet og hjernen, og dermed bevare korrekt homeostase 2, men også en begrænsning optagelse af terapeutiske lægemidler, hvilket hæmmer behandlinger af neurologiske lidelser 3. På celleniveau, er BBB hovedsageligt oppe af omfattende tætte forbindelser mellem endotelceller, polariseret udtryk for efflux transportvirksomheder og en meget lav transcytose på 4. Egenskaber og funktioner i BBB er for det meste fremkaldt af neighboring celler 4. Især pericytter spiller en vigtig rolle i induktion og vedligeholdelse af BBB 5,6. Bliver kontraktile celler, pericytter også regulere blodgennemstrømning 7 som gør de glatte muskelceller omgivende store skibe. Endelig astrocytter, de store gliaceller i hjernen, sende store processer navngivne endfeet omkring de fleste af hjernen vaskulaturen 8 og modulere BBB integritet og immune hviletilstand 9, overførsel af metabolitter neuroner 10 og inducere tætte kobling mellem neuronal aktivitet og blodgennemstrømning 11,12.
Evnen til at studere de molekylære og cellulære egenskaber af cerebrovaskulære system er afgørende for at karakterisere bedre dens bidrag til hjernen fysiologi og fysiopatologi. For at løse dette spørgsmål, er der udviklet strategier til at isolere hjernens cerebrovaskulær system, som gør det muligt for udarbejdelsen af intakte hjerne fartøj fragmenter. Cerebral fartøj purification blev oprindeligt beskrevet ved hjælp af bovine hjerner 13 og forbedret og tilpasset til andre arter, især gnavere 14. I denne sidste undersøgelse blev brugen af filtre af varierende størrelse indført for at adskille hjernen fartøjer på fraktioner beriget med fartøjer med forskellige diametre. Interessant nok i sådanne præparater, endotelceller holdt deres metaboliske egenskaber 15, transportør funktionalitet 16 og polarisering 17. Her beskriver vi i detaljer denne protokol, og yderligere at demonstrere, at isolerede beholdes meste af deres in situ strukturer. Endotelceller forblive forbundet med tight junctions og omgivet af en kontinuerlig basal lamina. Pericyter og glatte muskelceller forbliver fastgjort til endothellaget, samt perivaskulære astrocyt membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliaceller, neuroner og oligodendrocytter elimineret. Endelig beskriver vi en fremgangsmåde til at udføre immunfarvning på isolerede hjerne fartøjer. </p>
Indtil nu er de fleste af de molekylære og cellulære undersøgelser vedrørende cerebrovaskulær systemet er blevet udført på oprensede hjerne fartøj celler dissocieret ved celle-sortering hjælp celle specifikke reporter musestammer eller Immunofarvning-baserede procedurer 18,19. Selv om disse teknikker giver mulighed for isolering af næsten rene cerebrovaskulære cellepopulationer, isolerede celler mister deres helt in situ morfologi og interaktioner, der på sin side, i høj grad påvirker deres molekylære og cellulære egenskaber. Protokollen beskrevet her, giver mulighed for isolering af hele cerebrovaskulære fragmenter uden behov for specifikke antistoffer eller transgene mus pletter, giver et godt alternativ som den overordnede struktur af isolerede cerebrale kar er bevaret, således mindske konsekvenser for deres molekylære egenskaber. Isolerede fartøjer kan derefter anvendes til at studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som beskrevet for nylig 20,21 </sup>. Endelig i forhold til laser capture mikrodissektion 22,23 den nuværende protokol er billigt, let at udføre og hurtigt kan tilpasses på alle laboratorier.
Blod-hjerne-barrieren regulerer passagen af fysiologiske stoffer ind og ud af CNS og beskytter den mod potentielt skadelige stoffer er til stede i blodet. Det er involveret i adskillige CNS patologier, herunder neurodegenerative sygdomme 2 og hjernetumorer 28. Den ekstremt lave permeabilitet i BBB hæmmer også passagen af terapeutiske midler rettet mod neurale celler og udvikling af metoder til hensigt at reversibelt åbne BBB uden skadelige konsekvenser for hjernen er en meget aktiv inden f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af LABEX MemoLife og af ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la Sclerose da plaques)
Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |