We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.
I hjernen, det meste av det vaskulære systemet består av en selektiv barriere, blod-hjerne-barrieren (BBB) som regulerer utveksling av molekyler og immunceller mellom hjerne og blod. Videre den enorme nevronale metabolske etterspørsel krever et øyeblikk til øyeblikk regulering av blodstrøm. Spesielt, avvik i denne forskriften er etiologiske kjennetegner de fleste hjerne patologi; inkludert glioblastom, hjerneslag, ødem, epilepsi, degenerative sykdommer (ex: Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom), hjernesvulster, samt inflammatoriske tilstander som multippel sklerose, meningitt og sepsis-indusert hjernen dysfunksjoner. Dermed forstå signal hendelser moduler den cerebrovaskulær fysiologi er en stor utfordring. Mye innsikt i cellulære og molekylære egenskapene til de ulike celletyper som komponerer cerebrovaskulær system kan oppnås av primær kultur eller celle sortering fra ferske dissosiert hjernevev. Derimot,egenskaper som celle polaritet, morfologi og inter relasjoner er ikke vedlikeholdes i slike preparater. Protokollen at vi beskriver her er laget for å rense hjernen fartøy fragmenter, samtidig opprettholde strukturell integritet. Vi viser at isolerte kar består av endotelceller forseglet med tett veikryss som er omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes, glatte muskelceller, så vel som de perivaskulære astrocytt endfeet membraner forbli festet til endotel-lag. Til slutt beskriver vi hvordan du utfører farging eksperimenter på renset hjernen fartøy.
Riktig funksjon av sentralnervesystemet (CNS) krever en svært regulert ekstracellulært miljø, og dens metabolske krav er stor sammenlignet med andre organer 1. CNS er også meget følsom for et bredt spekter av kjemikalier, generelt ufarlig for perifere organer, men til det, neurotoksisk. For å sikre korrekt funksjon, de fleste av CNS 'blodkar danner en endothelial barriere; blod-hjerne-barrieren (BBB), som kontrollerer strømmen av molekyler og ioner, samt passasje av immunceller mellom blod og hjerne, for derved å opprettholde riktig homeostase 2, men også å begrense inntrengning av terapeutiske legemidler, og dermed hindrer behandlinger nevrologiske lidelser 3. På cellenivå, er BBB i hovedsak består av omfattende tett veikryss mellom endotelceller, polarisert uttrykk for efflux transportører og en svært lav transcytose sats 4. Egenskapene og funksjonene til BBB er hovedsakelig forårsaket av neighboring celler 4. Spesielt pericytes spiller en viktig rolle ved indusering og vedlikehold av BBB 5,6. Å være kontraktile celler, pericytes også regulere blodstrøm 7 som gjør de glatte muskelcellene rundt store fartøy. Til slutt, astrocytter, de store glialceller i hjernen, sende store prosesser oppkalt endfeet rundt mesteparten av hjernen vaskulaturen 8 og modulere BBB integritet og immun quiescence 9, overføring av metabolittene til nerveceller 10, og indusere tett kopling mellom neuronal aktivitet og blodstrøm 11,12.
Muligheten til å studere de molekylære og cellulære egenskapene til cerebrovaskulær system er avgjørende for å karakterisere bedre sitt bidrag til hjernen fysiologi og patofysiologi. For å takle dette spørsmålet, har strategier for å isolere hjernens cerebrovaskulær system er utviklet, som gir mulighet for utarbeidelse av intakte hjerne fartøy fragmenter. Cerebral fartøy purification ble opprinnelig beskrevet ved hjelp av bovin hjerne 13 og forbedret og tilpasset til andre arter, særlig gnagere 14. I denne siste studien, ble bruken av filtre av varierende størrelse innført for å separere hjernen fartøy i fraksjoner anriket på fartøyer med forskjellige diametre. Interessant, i slike preparater, endotelceller holdt sine metabolske egenskaper 15, transporter funksjonalitet 16 og polarisering 17. Her beskriver vi i detalj denne protokollen og videre vise at isolerte kar beholde mesteparten av sin in situ strukturer. Endotelceller forbli koblet av tett veikryss og omgitt av en kontinuerlig basal lamina. Pericytes og glatte muskelceller forbli festet til endotel-lag, samt perivaskulær astrocyttkulturer membraner. Imidlertid er astrocytter, mikrogliale celler, nerveceller og oligodendrocytter elimineres. Til slutt beskriver vi en prosedyre for å utføre farging på isolerte hjernen fartøy. </p>
Inntil nå har de fleste av de molekylære og cellulære studier om cerebrovaskulær system har blitt utført på renset hjerne fartøyet cellene dissosiert ved celle-sortering ved hjelp av celle bestemte reporter musestammer eller farging baserte prosedyrer 18,19. Selv om disse teknikkene tillater isolering av nesten ren cerebrovaskulære cellepopulasjoner, isolerte celler helt mister sin morfologi in situ og interaksjoner, som i sin tur påvirker i stor grad deres molekylære og cellulære egenskaper. Protokollen er beskrevet her, noe som åpner for isolering av hele cerebrovaskulære fragmenter uten behov for spesifikke antistoffer eller transgene mus flekker, tilbyr et godt alternativ som den overordnede strukturen av isolerte cerebrale kar er bevart, og dermed minske konsekvenser for deres molekylære egenskaper. Isolerte kar kan deretter bli brukt for å studere genaktivitet, proteinsyntese og regulering på BBB som nylig beskrevet 20,21 </sup>. Til slutt, sammenlignet med laser capture mikrodisseksjon 22,23 protokoll er billig, lett å utføre og raskt tilpasningsdyktig i et hvilket som helst laboratorium.
Blod-hjerne-barrieren regulerer passasjen av fysiologiske stoffer i og ut av CNS og beskytter den mot potensielt skadelige stoffer som er tilstede i blodet. Det er involvert i flere CNS sykdommer, inkludert nevrodegenerative sykdommer 2 og hjernesvulster 28. Den ekstremt lave permeabilitet av BBB hindrer også passasje av terapeutiske midler rettet mot nerveceller og utvikling av metoder har til hensikt å reversibelt åpne BBB uten noen skadelige konsekvenser for hjernen er et meget aktivt forskni…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av LABEX Hjerneklubben og ved ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose no plakk)
Tissue Grinder Size C | Thomas scientific | 3431E25 | |
centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
High-performance, Modular Stereomicroscope | Leica | MZ6 | |
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
low binding tips (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700 | |
Standard Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
Microscope Slides | Thermo Scientific | 1014356290F | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap | Thermo Scientific | AB-0266 | |
PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) | Sigma | P7793-1EA | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Life technology | 14175-129 | |
HEPES (1M) | Life technology | 15630056 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 | Sigma | 31390 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
PBS 10X | Euromedex | ET330 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
Triton™ X-100 | Sigma | X100 | |
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
Mounting medium Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 | Life technology | I21411 | |
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 | kindly provided by Dr Markus A Ruegg | ||
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilution 1:500 |
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) | Sigma | A2547 | dilution 1:500 |
Anti GFAP (mouse, clone GA5) | Sigma | G3893 | dilution 1:500 |
Anti AQP4 (rabbit) | Sigma | A5971 | dilution 1:500 |
Anti Cx43 (mouse, Clone 2) | BD Biosciences | 610061 | dilution 1:500 |
Anti Olig2 (rabbit) | Millipore | AB9610 | dilution 1:200 |
Anti NF-M (mouse) | provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland. | dilution 1:10 | |
Anti Iba1 (rabbit) | Wako | 019-19741 | dilution 1:400 |
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A11029 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate | Life technology | A11034 | dilution 1:2000 |
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technology | A21424 | dilution 1:2000 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate | Life technology | A21429 | dilution 1:2000 |